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Signification d'une unité de mesure de l'activité kinase


J'ai besoin d'aide pour savoir quoi $cpm x 10^3$ signifie dans la figure 4(C) de cet article (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022202X15323149#f0010). Il semble qu'il s'agisse d'une unité d'activité kinase.


Il ne s'agit pas d'une unité spécifique d'activité kinase, mais plutôt d'une approche générale adoptée pour suivre les réactions où il n'y a pas de changement de couleur. L'abréviation cpm signifie coups par minute et est une mesure de la radioactivité. Dans cet exemple particulier, un phosphate radioactif a été incorporé dans l'ATP du dosage de protéine kinase. Si la protéine kinase est active avec le substrat, le phosphate sera transféré de l'ATP au substrat peptide/protéine. Si le mélange d'échantillons est chargé sur un gel SDS-PAGE, un compteur à scintillation peut être utilisé pour mesurer la radioactivité de chaque bande et on pourra montrer à quel point la protéine kinase a été active dans la phosphorylation de son substrat.


Signification d'une unité de mesure de l'activité kinase - Biologie

Les concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) est une mesure de la puissance d'une substance à inhiber une fonction biologique ou biochimique spécifique. CI50 est une mesure quantitative qui indique la quantité d'une substance inhibitrice particulière (par exemple un médicament) nécessaire pour inhiber, in vitro, un processus biologique donné ou un composant biologique de 50 %. [1] Le composant biologique pourrait être une enzyme, une cellule, un récepteur cellulaire ou un micro-organisme. CI50 les valeurs sont généralement exprimées en concentration molaire.

CI50 est couramment utilisé comme mesure de la puissance d'un médicament antagoniste dans la recherche pharmacologique. CI50 est comparable à d'autres mesures de puissance, telles que la CE50 pour les drogues excitatrices. CE50 représente la dose ou la concentration plasmatique nécessaire pour obtenir 50 % d'un effet maximal in vivo. [1] [ lien mort ]

CI50 peut être déterminé avec des tests fonctionnels ou avec des tests de liaison par compétition.

Parfois, IC50 les valeurs sont converties en PIC50 escalader.

En raison du signe moins, des valeurs plus élevées de pIC50 indiquent des inhibiteurs exponentiellement plus puissants. PIC50 est généralement donné en termes de concentration molaire (mol/L, ou M), nécessitant donc IC50 en unités de M. [2]

Le CI50 la terminologie est également utilisée pour certaines mesures comportementales in vivo, telles qu'un test de consommation de liquide à deux bouteilles. Lorsque les animaux diminuent la consommation de la bouteille d'eau contenant du médicament, la concentration du médicament qui entraîne une diminution de 50 % de la consommation est considérée comme l'IC50 pour la consommation de liquide de ce médicament. [3]


Unité enzymatique

Les conditions spécifiées seront habituellement les conditions optimales, qui incluent, mais sans s'y limiter, la température, le pH et la concentration du substrat, qui donnent le taux de conversion maximal du substrat pour cette enzyme particulière. Dans certaines méthodes de dosage, on prend généralement une température de 25°C. [3]

L'unité enzymatique a été adoptée par l'Union internationale de biochimie en 1964. La minute n'étant pas une unité de temps de base SI, l'unité enzymatique est déconseillée au profit du katal, l'unité recommandée par la Conférence générale des poids et mesures en 1978. et officiellement adopté en 1999.

Un katal est l'activité enzymatique qui convertit une mole de substrat par seconde dans des conditions de dosage spécifiées, donc

1 U = 1 mol/min = 1/60 μmol/s ≈ 16,67 nmol/s 16,67 nkat = 16,67 nmol/s Donc, 1 U = 16,67 nkat [4]

Le concept d'unité enzymatique ne doit pas être confondu avec celui d'unité internationale (UI). Bien qu'il soit vrai que 1 U = 1 UI [5] (parce que, pour de nombreuses enzymes, l'U existant a été adopté comme UI ultérieure), des unités internationales peuvent être définies pour l'activité biologique de nombreux autres types de substances en plus des enzymes (par exemple exemple, vitamines et hormones).

  1. ^ Comité de nomenclature de l'Union internationale de biochimie (NC-IUB) (1979). "Unités d'activité enzymatique". EUR. J. Biochem. 97 (2) : 319-20. doi: 10.1111/j.1432-1033.1979.tb13116.x.
  2. ^
  3. "Terminologie des méthodes bioanalytiques (Recommandations IUPAC 2018)". Chimie Internationale. 40 (3) : 34. 01/07/2018. doi: 10.1155/ci-2018-0319 . ISSN1365-2192.
  4. ^ Principes de biochimie, page 94, 4e édition, Lehninger
  5. ^
  6. Wharton, Christopher W. Eisenthal, Robert (2013), Enzymologie moléculaire, Biologie de niveau tertiaire, Springer Science and Business Media, p. 82, ISBN9781461585329.
  7. ^
  8. Bommarius, Andreas S. Riebel-Bommarius, Bettina R. (2007), Biocatalyse : Fondamentaux et Applications, John Wiley et fils, p. 30, ISBN9783527606054.

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Il y a très peu de risques à faire un test sanguin. Vous pouvez ressentir une légère douleur ou des ecchymoses à l'endroit où l'aiguille a été insérée, mais la plupart des symptômes disparaissent rapidement.

Si vos résultats montrent que vous avez un taux de CK supérieur à la normale, cela peut signifier que vous souffrez d'une blessure ou d'une maladie des muscles, du cœur ou du cerveau. Pour obtenir plus d'informations, votre fournisseur peut commander des tests pour vérifier les niveaux d'enzymes CK spécifiques :

  • Si votre taux d'enzymes CK-MM est supérieur à la normale, cela peut signifier que vous souffrez d'une blessure ou d'une maladie musculaire, telle qu'une dystrophie musculaire ou une rhabdomyolie.
  • Si vous avez des enzymes CK-MB plus élevées que la normale, cela peut signifier que vous avez une inflammation du muscle cardiaque ou que vous avez ou avez récemment eu une crise cardiaque.
  • Si vous avez des enzymes CK-BB plus élevées que la normale, cela peut signifier que vous avez subi un accident vasculaire cérébral ou une lésion cérébrale.

D'autres conditions qui peuvent provoquer des niveaux de CK supérieurs à la normale comprennent :

Si vous avez des questions sur vos résultats, parlez-en à votre fournisseur de soins de santé.


Adresse actuelle : Adresse actuelle : Upper Austrian Research GmbH, Center for Biomedical Nanotechnology (CBN), Scharitzerstraße 6-8, 4020 Linz, Autriche.,

Céline I. Maeder et Mark A. Hink : Ces auteurs ont contribué à parts égales à ce travail.

Affiliations

Unité de biologie cellulaire et biophysique, EMBL-Heidelberg, Meyerhofstrasse 1, D-69117, Heidelberg, Allemagne

Céline I. Maeder, Reinhard Mayr et Michael Knop

Département de biologie cellulaire systémique, Institut Max Planck de physiologie moléculaire, Otto-Hahn-Str. 11, 44227, Dortmund, Allemagne


Conclusion

En utilisant ces biocapteurs pour sonder l'activité MAPK dans les voies d'accouplement et d'intégrité de la paroi cellulaire, nous avons pu révéler une grande hétérogénéité dans la réponse entre les cellules au sein d'une population isogénique. Pour la voie d'accouplement, cette variabilité peut s'expliquer par des différences extrinsèques entre les cellules. Alors qu'il était connu que la réponse à la phéromone d'accouplement était dépendante du cycle cellulaire avec une inhibition de la voie pendant la phase S, nous avons pu démontrer avec ces capteurs qu'il existe également une activation cinétique différente de la voie entre une fraction de G2/ Cellules M et cellules en phase G1. En phase S, la protéine d'échafaudage Ste5 est phosphorylée par le complexe Cln2/Cdc28 pour empêcher son recrutement au niveau de la membrane plasmique via le domaine PM [28]. Il reste à voir si le même mécanisme est impliqué dans la différence observée de cinétique entre les cellules G1 et G2/M. Dans la voie CWI, une hétérogénéité de la réponse peut également être observée entre les cellules individuelles. Elle ne peut pas être attribuée à des signaux spécifiques au cycle cellulaire, mais plutôt à la croissance générale des cellules qui induisent plus ou moins d'activité basale de la Mpk1 MAPK.

Ces deux exemples confirment l'idée que les voies MAPK ne sont pas des cascades de transduction de signal isolées, mais sont intégrées dans le réseau de signalisation global de la cellule. Les voies MAPK peuvent intégrer ces signaux intracellulaires pour moduler leur sortie, et à son tour l'activité MAPK peut avoir un impact sur les processus cellulaires tels que le cycle cellulaire, le métabolisme ou la croissance. La capacité de mesurer l'activité MAPK dans des cellules individuelles fournie par le SKARS nous permet de découvrir ces régulations et offre l'opportunité d'identifier les liens mécanistiques qui relient les voies MAPK à d'autres processus cellulaires. En général, la technologie SKARS permet les mesures directes de l'activité enzymatique dans les cellules vivantes et, en tant que telle, peut devenir un outil important pour la biologie des systèmes. Son utilisation permettra l'identification de nouveaux mécanismes de régulation présents dans ces cascades de signalisation et, à son tour, permettra de construire des modèles mathématiques plus précis des événements dynamiques se déroulant dans ces voies.


Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Données étendues Fig. 1 Identification et caractérisation d'ExRai-AKAR2.

une, Modifications maximales du rapport d'excitation de 480 nm/405 nm (ΔR/R) des variants de liaison ExRai-AKAR dans les cellules HeLa stimulées avec 50 M de Fsk et 100 M d'IBMX. Le candidat le plus performant a été désigné ExRai-AKAR2 (P = 0,0002, test t de Student bilatéral non apparié avec correction de Welch). De gauche à droite : n = 34, 27, 27, 31, 31, 49, 29, 27, 23, 30, 40, 30, 41, 24, 32, 43, 43, 40, 32, 45 et 30 cellules combinés à partir de 3 expériences indépendantes chacun. b, Structures de domaine d'ExRai-AKAR1 et ExRai-AKAR2. c, ExRai-AKAR2 est modestement mais significativement plus lumineux que ExRai-AKAR1 dans les deux canaux d'excitation (****P < 0,0001 test t de Student bilatéral non apparié avec correction de Welch). n = 227 (ExRai-AKAR1) et 136 cellules (ExRai-AKAR2) imagées dans plusieurs champs au cours de 4 et 5 expériences distinctes, respectivement. Les données sont tracées sous forme de valeurs d'intensité transformées en log. Les augmentations de luminosité pour chaque canal ont été calculées en soustrayant l'intensité logarithmique moyenne d'ExRai-AKAR1 de celle d'ExRai-AKAR2 puis en inversant la transformation logarithmique (10 x ). Par exemple, les intensités logarithmiques moyennes à 480 nm d'excitation pour ExRai-AKAR2 et ExRai-AKAR1 étaient respectivement de 3,129 et 2,883. Étant donné que 10 (3,129–2,883) = 1,762, nous concluons que ExRai-AKAR2 a

Intensité excitée à 480 nm 76% plus élevée, en moyenne, que ExRai-AKAR1. , ExRai-AKAR2 présente des changements d'intensité de fluorescence significativement plus importants dans les deux canaux d'excitation par rapport à ExRai-AKAR1 en réponse à la stimulation PKA (**** P < 0,0001 test t de Student bilatéral non apparié avec correction de Welch). n = 68 (ExRai-AKAR1) et 70 (ExRai-AKAR2) cellules combinées à partir de 3 expériences indépendantes. e,F, ExRai-AKAR2 présente un (e) changement de rapport d'excitation maximal de 488 nm/405 nm (ΔR/R) et (F) rapport signal/bruit par rapport à ExRai-AKAR1 dans des cellules HeLa stimulées avec Fsk/IBMX (****P < 0,0001 test t de Student bilatéral non apparié avec correction de Welch). Les données en f sont regroupées à partir de 3 (ExRai-AKAR2) et 4 (ExRai-AKAR1) expériences. Les barres d'erreur indiquent la moyenne ± s.e.m. Données ExRai-AKAR2 dans , e sont reproduits à partir de la Fig. 1c–e.

Données étendues Fig. 2 Comparaison des performances ExRai-AKAR2 avec les capteurs PKA précédents.

(une, b) Comparaison côte à côte d'ExRai-AKAR2 avec les capteurs PKA existants basés sur le rapport d'intensité. une, Temps moyen montrant la réponse de rapport améliorée (ΔR/R0) d'ExRai-AKAR2 (n = 18) versus ExRai-AKAR1 (n = 11), AKAR4 (n = 18) et AKAR3-EV (n = 18) dans des cellules HeLa stimulées avec 50 M de Fsk et 100 M d'IBMX (Fsk /IBMX). Les lignes pleines indiquent les réponses moyennes, les zones ombrées, s.d. b, Résumé des changements de rapport maximum (ΔR/R) pour ExRai-AKAR2 (n = 44), ExRai-AKAR1 (n = 39), AKAR4 (n = 38) et AKAR3-EV (n = 36) après Fsk/ Stimulation IBXM. Des images pseudocolores représentatives sous le graphique représentent l'émission brute (AKAR4, AKAR3-EV) ou le rapport d'excitation (ExRai-AKAR1, ExRai-AKAR2) avant (supérieur) et après (inférieur) la stimulation Fsk/IBMX. Des couleurs plus chaudes indiquent des ratios plus élevés. Barres d'échelle, 10 m. Les données sont représentatives de (une) ou combiné à partir de (b) 2 expériences indépendantes. Barres d'erreur dans b indiquer la moyenne ± s.e.m. c, Fsk dose-réponse d'ExRai-AKAR2. Des cellules HeLa exprimant ExRai-AKAR2 (n = 48) ont été successivement stimulées avec les concentrations indiquées de Fsk, suivies de 100 µM d'IBMX. Les données sont tracées sous la forme ΔR/ΔRmax = (R[Fsk]-R0)/(RIBMX − R0), où R[Fsk] est le rapport maximum enregistré après l'ajout d'une dose Fsk donnée, RIBMX est le rapport maximum enregistré suite à l'ajout d'IBMX à la fin de l'expérience, et R0 est le rapport enregistré immédiatement avant la première addition de médicament (par exemple, t = 0). Les données sont combinées à partir de 2 expériences indépendantes. Les lignes pleines et en pointillés indiquent respectivement la médiane et les quartiles. ****P < 0,0001 vs 0 test bilatéral signé Wilcoxon.

Données étendues Fig. 3 Détection de la signalisation PKA locale avec ExRai-AKAR2 ciblé de manière subcellulaire.

une, Structures de domaine des constructions ExRai-AKAR2 ciblées sur la membrane plasmique, la membrane mitochondriale externe et la membrane du RE. b, Images de fluorescence confocale représentatives montrant la membrane plasmique, la mitochondrie et la localisation du RE de pmExRai-AKAR2, mitoExRai-AKAR2 et erExRai-AKAR2, respectivement, dans les deux canaux d'excitation (Ex488, Ex405). Pour mito- et erExRai-AKAR2, des images du signal de fluorescence rouge (Ex561) de MitoTracker RED et ER-Tracker RED, respectivement, sont également affichées. Les images fusionnées (à l'extrême droite) représentent la superposition des canaux Ex488 (jaune), Ex405 (cyan) et Ex561 (magenta). Les images sont représentatives de 2 expériences indépendantes par condition. ce, Tracés temporels montrant toutes les traces individuelles correspondant aux réponses brutes du rapport d'excitation 480/405 de pmExRai-AKAR2 (à gauche), mitoExRai-AKAR2 (au milieu) et erExRai-AKAR2 (à droite), ainsi que des images d'épifluorescence représentatives des deux excitations canaux (ci-dessous) illustrant la sélection du retour sur investissement (lignes blanches en pointillés), pour les expériences illustrées aux figures 2a–c. Les lignes épaisses indiquent les réponses moyennes et les lignes fines représentent les traces individuelles d'une seule cellule. Barres d'échelle dans bc, 10 um. F, Résumé des changements de rapport d'excitation maximum (ΔR/R) pour pmExRai-AKAR2 (PM n = 46 cellules de 3 expériences), mitoExRai-AKAR2 (Mito n = 43 cellules de 4 expériences) et erExRai-AKAR2 (ER n = 35 cellules issues de 3 expériences) dans des cellules HeLa stimulées avec Fsk/IBMX. Barres d'erreur dans indiquer la moyenne ± s.e.m.

Données étendues Fig. 4 ExRai-AKAR2 est une sonde FACS plus sensible que ExRai-AKAR1.

Les cellules HEK293T transfectées avec ExRai-AKAR1 ont été analysées par cytométrie en flux avant et après stimulation avec 50 M de Fsk et 100 M d'IBMX comme décrit dans les Méthodes. une, Graphique de contour montrant les intensités de fluorescence excitées à 488 nm et 405 nm des cellules transfectées sans (sarcelle) et avec (vert) stimulation Fsk/IBMX. b, Distribution de fréquence du rapport d'excitation de 488 nm/405 nm illustrant le changement de population provoqué par la stimulation Fsk/IBMX (****P < 0,0001 test de Kolmogorov-Smirnov). Les données sont représentatives de 3 expériences indépendantes. Les lignes pointillées grises et noires superposées représentent les distributions de fréquence pour les populations de cellules transfectées ExRai-AKAR2 avant et après le traitement Fsk/IBMX, respectivement (redessiné à partir de la figure 3a). c, Tableau récapitulatif des valeurs d'entrée et des résultats du calcul de l'indice de sensibilité (IS) (voir Méthodes). ExRai-AKAR2 montre une sensibilité 2 fois plus élevée par rapport à ExRai-AKAR1.


Remerciements

Nous remercions R. Huber et tous les membres du groupe Clausen pour leurs remarques sur le manuscrit et les discussions, J. Leodolter et M. Madalinski pour leur soutien dans la préparation des peptides contenant pArg, A. Schleiffer pour l'aide à l'analyse bioinformatique, A. Sedivy et P Stolt-Bergner pour son assistance dans les mesures de spectroscopie CD, N. Stanley-Wall (Université de Dundee) pour le plasmide pMAD et ses conseils sur la mutagenèse dans B. subtilis, et le personnel des lignes de lumière à l'ESRF (Grenoble), SLS (Villigen) et DESY (Hambourg) pour leur excellente aide lors de la collecte des données. Ce travail a été soutenu par une subvention du Conseil européen de la recherche (AdG 694978, à T.C.). L'IMP est soutenu par Boehringer Ingelheim.


Résultats

Conception du capteur

Les séquences de localisation nucléaire (NLS) consistent en un tronçon de résidus chargés positivement associés à l'importine, qui transportera ensuite sa cargaison dans le noyau [14]. Harreman et al. [15] ont démontré que des charges négatives supplémentaires autour du NLS compromettent sa liaison à l'importine et diminuent ainsi l'enrichissement de la cargaison dans le noyau. De plus, ils ont observé que le NLS pour le cofacteur de transcription Swi6 était dirigé par une sérine, qui est une cible potentielle de phosphorylation. En effet, la mutation de ce résidu en une alanine a abouti à une protéine Swi6 constitutivement nucléaire. Sur la base de ces résultats, nous avons utilisé le Swi6 NLS comme cible de phosphorylation pour notre capteur, avec l'idée que la phosphorylation conduirait à une sortie du capteur du noyau. Pour augmenter l'efficacité de la relocalisation, nous avons ajouté un deuxième site de phosphorylation après l'étirement positif des acides aminés et combiné deux de ces NLS dans notre capteur (Fig. 1a).

La relocalisation de SKARS dépend d'un site d'amarrage intact et de la phosphorylation de NLS par MAPK. une Schéma des trois domaines du capteur SKARS : le site d'amarrage (DS), le signal de localisation nucléaire (NLS) et la protéine fluorescente (RFP). Le Ste7DS-NLS-RFP SKARS est composé du site d'amarrage Ste7 (Ste7DS, acides aminés 1-33), un double NLS et la protéine mCherry. b Images microscopiques de cellules avant et après stimulation avec le facteur . Dans le canal rouge, on peut observer la sortie nucléaire du capteur après stimulus tandis que le signal du marqueur d'histone CFP reste stable. c–f Après quantification des films time-lapse, le rapport de fluorescence nucléaire à cytoplasmique est tracé en fonction du temps. La réponse des cellules portant le capteur fonctionnel et stimulées avec 1 M de facteur (Nc = 170, même courbe sur les panneaux c à F) est comparé à des cellules non stimulées (Nc = 550, c) ou aux cellules déficientes pour la transduction du signal (ste11∆, Nc = 360, ), des cellules portant une variante non amarrée du capteur (Ste7ND, Nc = 300, e), ou un non phosphorylable (NLS-4A, Nc = 360, F) ou variante phospho-imitant du capteur (NLS-4E, Nc = 750, F). Les mesures sans unité, telles que le rapport Nucl/Cyto, sont indiquées par le symbole [–] dans la légende de l'axe. Pour tous les graphiques similaires et sauf indication contraire, les lignes pleines représentent la médiane de la population cellulaire et la zone ombrée les 25 et 75 centiles de la population. Nc représente le nombre de cellules individuelles mesurées

Toutes les MAPK partagent le même motif de phosphorylation consensus SP ou TP. La spécificité est obtenue via une surface d'interaction dans la kinase appelée rainure d'amarrage. Ce motif s'associe à un site d'accueil (DS) avec le motif consensus (R/K)1-2-X4-6-LXL, qui a été identifié sur les substrats MAPK ainsi que sur les phosphatases MAPK et les activateurs en amont (MAP2K) [16–18]. Ces motifs d'interaction sont présents chez tous les eucaryotes, de la levure aux mammifères. Il a été démontré que l'échange de cette DS dicte la spécificité envers un substrat ou, dans le cas d'une MAP2K, contrôle la spécificité de la MAPK activée [19, 20]. Le groupe de Wendell Lim a caractérisé différents DSs qui interagissent avec Fus3 et Kss1 [20]. Nous avons utilisé les 33 premiers acides aminés de Ste7, qui contient la DS ayant la plus forte affinité envers Fus3 et Kss1. Le Ste7DS et la construction double-NLS a été fusionnée à mCherry (Fig. 1a). Comme le montre la figure 1b, le capteur est enrichi dans le noyau dans des conditions de croissance végétative. Lors de la stimulation des cellules avec le facteur , la protéine fluorescente se déplace rapidement vers le cytoplasme. La segmentation automatisée des images permet l'identification du noyau et du cytoplasme pour chaque cellule (Fichier supplémentaire 1 : Figure S2) [21]. Le rapport des intensités moyennes dans le noyau et dans le cytoplasme est calculé en fonction du temps pour chaque cellule. Les médianes, 25 et 75 centiles de la population sont tracées pour les cellules traitées avec 1 M de facteur ou des cellules non stimulées (Fig. 1c). Au début de l'expérience, le rapport est élevé, dénotant un enrichissement du capteur dans le noyau. Lors de l'ajout du facteur , ce rapport chute en quelques minutes. Ce résultat suggère que le capteur est phosphorylé par Fus3 et Kss1 en réponse au traitement par le facteur , conduisant à sa relocalisation du noyau vers le cytoplasme.

Pour démontrer la spécificité de cette réponse, nous avons répété cette expérience dans des cellules déficientes pour l'activation de MAPK (ste11∆), dans laquelle le capteur est resté enrichi dans le noyau lors de la stimulation (Fig. 1d). Nous pouvons en outre démontrer que cette réponse dépend d'un DS intact. En effet, la mutation du DS de Ste7 abolit la réponse (Fig. 1e). De plus, la mutation des quatre sérines dans les deux NLS en résidus phospho-imitants (acide glutamique : NLS-4E) ou en résidus non phosphorylables (alanine : NLS-4A) modifie la localisation de la protéine fluorescente dans la cellule, mais ni de ces constructions présentent un changement dans la partition nucléaire à cytoplasmique lors de la stimulation par les phéromones (Fig. 1f).

Enfin, nous avons également vérifié que l'inhibition directe de la MAPK à l'aide d'un allèle sensible aux analogues bloquait la phosphorylation et donc la relocalisation des SKARS (fus3-as dans fus3∆kss1∆, fig. 2a) [22]. Fait intéressant, l'ajout de l'inhibiteur après l'activation de la voie conduit à un retour rapide du capteur à son niveau d'enrichissement nucléaire basal, sous-tendant la nature dynamique de la phosphorylation du biocapteur (Fig. 2b). Pris ensemble, ces résultats démontrent clairement que nous avons généré un capteur spécifique pour l'activité Fus3 et Kss1. La relocalisation dépend d'une kinase active qui se lie au capteur via le DS spécifique et phosphoryle les sérines dans les NLS. Cette modification est réversible, permettant une mesure dynamique de l'activité MAPK.

L'inhibition du MAPK Fus3 empêche le déplacement du capteur. fus3∆kss1∆ cellules portant le Ste7DS-NLS-RFP SKARS et un fus3-as ont été stimulés par la phéromone en présence ou en l'absence de l'inhibiteur NAPP1. une Du NAPP1 ou du DMSO ont été ajoutés 8 minutes avant l'ajout du facteur . Le rapport nucléaire sur cytoplasmique médian est tracé en fonction du temps (NAPP1 : Nc = 343, DMSO : Nc = 230). b Dix minutes après la stimulation du facteur , les cellules ont été traitées avec du NAPP1 ou du DMSO. A noter que, lors de l'inhibition de Fus3-as, le capteur revient dans les 7 minutes à son niveau d'enrichissement nucléaire basal (NAPP1 : Nc = 177, DMSO : Nc = 123)

Pour évaluer si la présence du SKARS perturbe la réponse d'accouplement des cellules, nous avons confirmé que les cellules pouvaient arrêter leur cycle cellulaire et former des projections d'accouplement (Fichier supplémentaire 1 : Figure S3A et B). Ces tests qualitatifs n'ont révélé aucune différence entre les cellules portant les versions amarrées ou non du capteur. Cependant, nous avons noté une différence mineure dans la réponse transcriptionnelle des cellules due à la présence du capteur en quantifiant par cytométrie de flux l'expression de la pFIG. 1-quadrupleVenus expression reporter [23] (Fichier supplémentaire 1 : Figure S3C). Cette légère augmentation de l'expression pourrait potentiellement s'expliquer par un enrichissement mineur des MAPK dans le noyau induit par la présence du capteur. Cependant, cet artefact ne doit pas empêcher une mesure fidèle de la dynamique de l'activité MAPK.

Déduire l'activité MAPK

Pour extraire l'activité MAPK des mesures de relocalisation du capteur, nous avons développé un modèle mathématique simple décrivant la relation entre la concentration relative du capteur dans le noyau et dans le cytoplasme et l'activité de MAPK. La figure 3a est un schéma des différentes réactions incluses dans le modèle (Fichier supplémentaire 1 : Texte supplémentaire et Tableau S1 et S2). Une MAPK et une phosphatase régulent le niveau de phosphorylation du capteur. L'action de la phosphatase est constitutive. La concentration de MAPK dans la cellule est constante cependant, le rapport de MAPK active (MAPKActivité défini comme la fraction du pool MAPK total à l'état actif) change en fonction du temps. Pour simplifier, nous considérons que ces réactions se produisent avec des constantes de vitesse similaires dans le noyau et dans le cytoplasme. Le capteur peut diffuser librement entre le noyau et le cytoplasme (kDiff), mais seul le SKARS non phosphorylé est activement importé dans le noyau (kLutin). Le modèle peut être simulé vers l'avant en générant un cours de temps spécifique de MAPKActivité (Fig. 3b) et calcul de la partition nucléaire à cytoplasmique résultante du capteur (Fig. 3c). À l'état d'équilibre, il existe une relation proche de linéaire entre la MAPKActivité et le rapport nucléaire à cytoplasmique du capteur (Fig. 3d).

Détermination de l'activité MAPK à partir de mesures de biocapteurs. une Schéma des réactions mises en œuvre dans le modèle. Le SKARS est phosphorylé dans le noyau et dans le cytoplasme par MAPK et déphosphorylé par la phosphatase. L'échange de SKARS entre le cytoplasme et le noyau peut se produire par diffusion passive, alors que seul le SKARS non phosphorylé est activement importé dans le noyau. avant JC L'évolution temporelle de l'activité de MAPK est calculée pour différents niveaux finaux d'activité de MAPK et utilisée comme entrée dans le modèle (b). La partition nucléaire à cytoplasmique résultante du capteur pour ces différentes traces d'activité MAPK est obtenue en sortie (c). Corrélation entre l'activité MAPK et le rapport nucléaire/cytoplasmique à la fin de la simulation. e Courbe dose-réponse de l'enrichissement nucléaire du capteur en fonction de la concentration après 15 minutes de stimulation par phéromone (cercles bleus). La moyenne et l'écart type de trois mesures sont tracés. Le niveau d'activité MAPK correspondant est calculé (cercles rouges). À titre de référence, le rapport nucléaire sur cytoplasmique du capteur non stimulé sans ancrage et son niveau correspondant d'activité MAPK sont indiqués par des carrés bleus et rouges. F Détermination de l'activité MAPK pour l'expérience à partir de la figure 2b. Les cercles bleus correspondent aux points de données expérimentales. La ligne bleue en pointillés représente l'ajustement de ces points par le modèle. La ligne rouge continue est l'activité MAPK extrapolée pour ce cours de temps

Nous pouvons également utiliser le modèle pour estimer l'activité MAPK sur la base d'un rapport nucléaire à cytoplasmique mesuré. Nous avons quantifié l'enrichissement nucléaire à l'état d'équilibre du capteur dans une population de cellules 15 minutes après induction avec diverses concentrations de facteur (Fig. 3e). Sur la base de ces données, nous pouvons obtenir la courbe dose-réponse de MAPKActivité, qui s'étend de 0,2 pour un échantillon non stimulé à 1 pour des taux de phéromone saturants (1 M). Un MAPKActivité de 1 implique que Fus3 et Kss1 sont complètement phosphorylés dans des niveaux de saturation de phéromone. Bien que ce niveau puisse sembler élevé, une étude récente sur la voie HOG suggère que près de 100 % de MAPK Hog1 est phosphorylée lors d'un choc hyper-osmotique [24]. Un mutant non amarré est utilisé comme référence et n'affiche pas de MAPKActivité. Il a été démontré que HOG et les voies d'accouplement ont un certain niveau basal d'activité MAPK dans des conditions de croissance normales [25]. Le niveau exact de ce signal basal est difficile à estimer, mais nous observons systématiquement une augmentation de l'enrichissement nucléaire du capteur dans la signalisation des cellules mortes ainsi que dans les versions non amarrées du capteur.

En utilisant une stratégie similaire, la dynamique de l'activité MAPK peut être estimée à partir des mesures temporelles de la relocalisation du capteur. Comme preuve d'un concept, nous utilisons l'activation et l'inhibition de la voie par le facteur et l'ajout ultérieur d'inhibiteur présenté sur la figure 2b. Avant le stimulus, le MAPKActivité était faible. Lors de l'ajout de facteur , il a atteint 0,8 en moins de 3 minutes après le stimulus. Après inhibition, MAPKActivité baissé à un rythme beaucoup plus lent. Cette décroissance est contrôlée par de multiples facteurs tels que le temps d'entrée du médicament dans la cellule, la déphosphorylation du biocapteur et sa sortie par diffusion hors du noyau. Ce modèle mathématique démontre qu'il existe une relation étroite entre la localisation SKARS et l'activité MAPK et qu'en utilisant quelques hypothèses simples, il est possible d'extraire l'activité MAPK moyenne de la population à partir des mesures expérimentales.

Mesures à cellule unique

Alors qu'une sortie nette du capteur hors du noyau peut être mesurée au niveau de la population, nous avons ensuite voulu vérifier si nous pouvions également obtenir des mesures d'activité kinase au niveau de la cellule unique. Nous avons remarqué qu'il existe une grande variabilité dans l'enrichissement nucléaire du capteur entre les cellules individuelles avant l'induction (Fichier supplémentaire 1 : Figure S4A). Cette grande différence pourrait provenir d'une activité basale variable de la voie [25] ou d'une capacité intrinsèque d'une cellule donnée à accumuler le capteur dans le noyau. Pour différencier ces deux possibilités, nous avons combiné une fonction (Ste7DS-NLS-YFP) et un capteur non fonctionnel (Ste7ND-NLS-RFP) dans la même cellule. Nous définissons le niveau basal comme le rapport nucléaire-cytoplasmique du SKARS avant l'induction (Fichier supplémentaire 1 : Figure S4A). En utilisant cette mesure, nous observons une forte corrélation entre l'enrichissement nucléaire des deux capteurs au sein d'une cellule, ce qui démontre que chaque cellule a une capacité inhérente à importer le capteur (Fichier supplémentaire 1 : Figure S4B). De toute évidence, dans les cellules affichant un enrichissement nucléaire plus élevé du capteur, le changement du rapport nucléaire à cytoplasmique lors de la stimulation est plus facile à quantifier (Fichier supplémentaire 1 : Figure S4A). Pour permettre une comparaison équitable entre chaque trace individuelle de cellule, ils ont été normalisés par leurs niveaux basaux. Pour chaque trace individuelle, la réponse initiale (3 à 5 minutes après le stimulus) et la réponse finale (les trois derniers points du time-lapse) ont été quantifiées (Fichier supplémentaire 1 : Figure S4C à E).

Le rapport nucléaire à cytoplasmique normalisé d'environ 300 cellules individuelles a été trié en fonction de leurs réponses finales et affiché dans une carte thermique où chaque ligne correspond à une trace cellulaire unique (Fig. 4a). Dans la partie inférieure de la carte, les cellules affichant un grand changement dans l'enrichissement nucléaire à cytoplasmique lors de la stimulation sont regroupées (réponse finale élevée). La partie supérieure de la carte représente une fraction de la population où aucune réponse n'est détectée. Pour discriminer les cellules répondantes de celles qui ne répondent pas, nous avons comparé les réponses monocellulaires de deux souches portant soit le capteur d'amarrage, soit le capteur de non-amarrage (Ste7DS-NLS-RFP et Ste7ND-NLS-RFP, respectivement). En utilisant le capteur non fonctionnel comme référence, nous avons défini un seuil pour discriminer entre les cellules répondantes et les cellules non répondantes portant le capteur fonctionnel (Fichier supplémentaire 1 : Figure S4F à H). Environ 17 % des cellules mesurées ont ainsi été caractérisées comme non répondantes (Fig. 4b).

Analyse unicellulaire de l'activité MAPK lors de la stimulation par les phéromones. une Carte thermique de la réponse des cellules individuelles à 1 M de facteur . Chaque ligne représente le rapport nucléaire sur cytoplasmique d'une seule cellule normalisé par son niveau basal (Nc = 293). Les réponses cellulaires ont été triées en fonction du niveau de réponse finale (mesuré à T = 12 min). Les cellules ont été classées comme répondant (cyan), ne répondant pas (vert) ou répondant lentement (bleu). Le niveau basal de chaque tracé est indiqué en nuances de rouge (du noir au rouge, niveau basal croissant). b Nuage de points de la réponse initiale et finale des cellules. Chaque point correspond à une mesure de cellule unique. La couleur indique à quelle sous-population les cellules appartiennent. c Évolution temporelle du rapport nucléaire sur cytoplasmique lors d'un traitement aux phéromones. La ligne continue représente la réponse moyenne de chaque sous-population. Les lignes pointillées sont des traces des trois cellules simples encerclées dans le panneau (b). , e, F Images des cellules sélectionnées dans le fond clair, CFP (étiquette histone) et RFP (Ste7DS-NLS-RFP) à différents moments. La ligne sombre dans l'image en fond clair représente le contour cellulaire segmenté

Dans le groupe des cellules répondantes, nous avons également pu différencier deux types de réponses. A small fraction (11 %) of the total cell population displayed a delayed response, characterized by an initial response weaker than the final response (arbitrarily defined as more than a 50 %-fold difference, Fig. 4b). Figure 4c represents the mean response of the cells in the defined categories (solid lines) as well as the response of one cell from each sub-population (dotted line), identified by a circle in panel B. Images of these same cells are also provided in panels D, E, and F. The heterogeneity in the dynamics of SKARS between these three populations of cells suggests that they have very different levels of MAPK activity, which may be linked to an intrinsic difference in their ability to respond to mating pheromone.

It is indeed well-established that the signaling activity in the mating pathway is dependent on the cell cycle stage [26–28]. Cells which are committed to division and have entered the S-phase become refractory to signal transduction. To correlate cell cycle stage with the dynamics of the SKARS, we tagged Whi5 and Yox1 with mCitrine in cells bearing the sensor. Whi5 is a repressor of G1 transcription and accumulates in the nucleus of the cells during G1 (Fig. 5a). It has been used previously as a marker for G1-entry and exit [29]. Yox1 is a transcription repressor that inhibits the expression of cell cycle regulated genes induced in the M and G1 phases [30]. It enters the nucleus upon S-phase entry and remains there until the beginning of G2 (Fig. 5b). As expected, cells with nuclear Whi5 were predominantly responding (Fig. 5c, dark blue dots). In contrast, a large fraction of the Yox1 positive cells were non-responding (Fig. 5d, light blue dots). Cells with cytoplasmic Whi5 were equally split between non-responding and responding cells. Based on the Yox1 data, we can assume that these non-responding cells are mainly S-phase cells (4C, light green dots) and, therefore, the responding ones are G2/M cells (4C, dark green dots). Similarly, we can assume that the Yox1-negative population, which displays a response, is dominated by G1 cells (4D, dark green dots), while responding cells with a Yox1-positive signal must be in the G2 phase (4D, dark blue dots).

Cell cycle dependent dynamics of signaling in the mating pathway. a, b Yeast cells expressing the Ste7DS-NLS-RFP sensor and Whi5 tagged with mCitrine (une) or Yox-1 tagged with mCitrine (b) imaged before and after stimulation with α-factor. c, Correlation between the measured Whi5 (Nc = 616, c) and Yox1 (Nc = 698, ) nuclear enrichment (nuclear – cytoplasmic intensities) measured before stimulation and the sensor’s final response. The scatter plot is split in four quadrants. The blue dots represent cells with an enriched nuclear marker, while the green dots represent cells where no enrichment is detected. The dark and light coloured dots represent, respectively, responding and non-responding cells. e, f Average response of the four sub-populations of cells in the four quadrants delimited on panels c (Whi5, e) et (Yox1, F). The colour code is the same as in (c) et ()

Taken together, these results are in general agreement to what was previously known: G1, M, and G2 cells are permissive to α-factor signaling while S-phase cells are refractory to this stimulus. However, these data also offer some additional insights about this regulation. First of all, there is a clear kinetic difference in the activation of the sensor between G1 cells and G2/M cells. In G1 cells, the sensor exits the nucleus within 3 to 4 minutes after the stimulus, while the G2/M cells seem to display a slower response (Fig. 5e, dark blue vs. dark green curves). This sub-population of cells is clearly enriched for slow responding cells (Additional file 1: Figure S5). This suggests that Fus3/Kss1 activity in this phase of the cell cycle is reduced. The second interesting observation is the fact that almost all sub-populations display an early exit of the sensor, which subsequently returns to basal value for non-responding cells (Fig. 5e, light green curve and 5f light blue curve). This hints at a transient activation of the pathway at early time-points, which cannot be sustained if the cells are not in the proper cell cycle stage.

Combination of sensors

In the previous experiment, SKARS were associated with fluorescently tagged proteins to correlate kinase activity and cell cycle stage. In a similar manner, we can envision to combine multiple SKARS in the same cell to correlate the activity of different kinases. Indeed, the fluorescent protein in the sensor is an inert bystander of the relocation process and its exchange should not affect the response of the sensor. To verify this statement, we combined an RFP and a YFP version of the sensor (Ste7DS-NLS-RFP and Ste7DS-NLS-YFP) in the same strain. While there is a slight difference between the YFP and RFP ratio measured with the sensor, the dynamics of the response measured with both sensors are strikingly similar (Fig. 6a). At the single cell level, we measured a high correlation between the final responses measured with each sensor (Additional file 1: Figure S6A).

Generation of a Fus3-specific sensor based on the Far1 docking site. une Combination in the same cell of two sensors bearing the same Ste7DS but tagged with mCherry or mCitrine and stimulated at time 0 with 1 μM α-factor (Nc = 660). The ratios were plotted on two different y-axes (left: Ste7DS-NLS-YFP, right: Ste7DS-NLS-RFP) to allow a direct comparison of the dynamic response of both sensors. b Engineering of a Fus3-specific sensor by replacing the Ste7 docking site by the Far1 docking site sequence (Far1DS). c Response of cells of different background (WT (blue, Nc = 630), fus3∆ (green, Nc = 474), kss1∆ (red, Nc = 990), and fus3∆kss1∆ (cyan, Nc = 952)) bearing the Far1DS-NLS-RFP (left) and the Ste7DS-NLS-YFP (right) stimulated with α-factor 1 μM. Histograms of the final response of cells in the YFP and RFP channel. The asterisks designate distributions that are significantly different (t-test, P <0.001) from the non-responding fus3∆kss1∆ contrôler

The Ste7 DS allows the sensing of the combined activity of Fus3 and Kss1. In their analysis of MAPKs DSs, Lim et al. [20] revealed the difference in structure between the DS of Ste7, which binds both Fus3 and Kss1, and the DS of Far1 that is specific for Fus3. The presence of two prolines in the Far1DS forces binding to MAPK via a different conformation that is not compatible with the Kss1 docking groove. To test whether we could confer Fus3 specificity to our sensor, we replaced the 11 amino acids in the Ste7DS by the 13 residues forming the Far1DS (Fig. 6b). To test the specificity of this sensor, we combined the Far1DS-NLS-RFP and Ste7DS-NLS-YFP sensors in the same cells and quantified their responses in wild-type (WT) and MAPK deletion strains (Fig. 6c and d). Both sensors relocate in WT and kss1∆ backgrounds. As expected, all relocation is abolished in the double MAPK deletions fus3∆kss1∆. Fait intéressant, dans fus3∆ cells, only the Ste7DS-NLS-YFP sensor exits the nucleus upon α-factor stimulation, demonstrating the specificity of the Far1DS for phosphorylation by the Fus3 MAPK. The histogram of the final response measured in individual cells is displayed in Fig. 6d. Dans fus3∆ cells, a weak but statistically significant activation of the pathway can be detected. Note also that the basal nuclear enrichment of the Ste7DS-NLS-YFP sensor in this strain is lower, which suggests that, in the absence of Fus3, there is a slightly higher level of MAPK activity. It is in agreement with previous observations showing that Kss1 is overexpressed and displays a higher basal activity in a fus3∆ background [31]. It is noteworthy to mention that both the dynamics and level of kinase activity in WT and kss1∆ cells are very similar, arguing for a predominant contribution of Fus3 to the response of the cells when stimulated with 1 μM α-factor.

Cell wall integrity pathway

Since the DS of the sensor dictates its specificity, we next tried to identify a DS for the MAPK of the CWI pathway, Mpk1. Molina et al. [32] identified a sequence in the N-terminus of the MAP2Ks Mkk1 and Mkk2 of S. cerevisiae that is conserved in other fungi and share some homology with the consensus DS of MAPKs (Fig. 7a). We therefore cloned the first 33 amino acids of Mkk2 in front of the NLS-RFP construct to generate an Mpk1-specific SKARS. When integrated in cells, this sensor turned out to be mostly cytoplasmic, suggesting that a high basal activity of the MAPK resulted in a constitutive phosphorylation of the sensor. Indeed, this localization was Mpk1 activity dependent since deletion of the MAP3K Bck1 leads to an enrichment of the sensor in the nucleus (Additional file 1: Figure S7A and B).

Mpk1 activity dynamics upon zymolyase or hypo-osmotic stresses. une Schematic of the Mpk1 sensor and alignment of the docking sites present in Mkk1 and Mkk2. b Scheme of the activation of Mpk1 by zymolyase or hypo-osmotic stress. c Dynamic localization of the Mkk2DS1-100-NLS-RFP sensor quantified by its change in nuclear-to-cytoplasmic ratio upon stimulation by zymolyase 3 U/mL at time 0 in WT (red, Nc = 313), ste11∆ (blue, Nc = 160), and bck1∆ (green, Nc = 80). Histograms of the final response after zymolyase stress measured in the WT and two deletion strains. e Mpk1 sensor relocation upon hypo-osmotic shock performed in microfluidic devices where the sorbitol concentration in the medium is lowered from 1 M to 0.5 M: WT (red, Nc = 168), ste11∆ (blue, Nc = 180), and bck1∆ (green, Nc = 217). F Histograms of the final response after hypo-osmotic stress measured in the WT and two deletion strains. In panels D and F the asterisks designate distributions that are significantly different (t-test, P <0.001) from the bck1∆ contrôler

To modulate the sensitivity of the sensor, we changed the distance separating the DS and the NLS. Mkk2 N-terminal fragments of different lengths (from 1–27 to 1–150 amino acids) were cloned in front of the NLS hoping that the distance between the DS and the phosphorylation sites would tune the ability of Mpk1 to phosphorylate the sensor. While we did not detect a simple relationship between the length of the spacer and the basal level of nuclear localization of the SKARS (Additional file 1: Figure S7C to F), we could identify one construct, DS1-100, which displayed the highest enrichment in nuclear fluorescence. Nonetheless, the nuclear enrichment of this SKARS was still highly variable from cell to cell, suggesting that cells within a population can display a wide range of Mpk1 activities.

To test whether the Mkk2DS1-100 sensor could report on Mpk1 activation by acute cell wall stress, cells were subjected to zymolyase treatment. It has been previously reported that in order to activate Mpk1 upon zymolyase stress, activity of the HOG pathway via Ste11 and Pbs2 is required (Fig. 7b) [6]. Due to the very large difference in basal value between bck1∆ cells on one side and WT and ste11∆ on the other, the latter strain offered a better comparison for the response measured in WT cells (Fig. 7c). When measured at the population level, the WT cells stressed with zymolyase displayed a slow gradual relocation of the sensor out of the nucleus. As expected, this translocation was blocked in bck1∆ as well as in ste11∆, implying that Mpk1 was not activated in these mutants (Fig. 7d).

In order to verify that the response of the SKARS was specific to the Mpk1 pathway, we also stressed cells with hypo-osmotic shock, where CWI activation is independent of the HOG pathway (Fig. 7b). To perform this experiment, cells were grown in medium complemented with 1 M sorbitol. The cells were loaded in a microfluidic chip and the medium was exchanged within seconds by medium containing 0.5 M sorbitol. The sensor transiently exited the nucleus and returned to a stable value slightly lower than the original basal value. Ste11 was not required for this response, as the ste11∆ cells displayed a response comparable to the WT cells. Dans bck1∆ cells, only a small drop in the nuclear-to-cytoplasmic ratio was detected corresponding to the expansion of the cell in the lower osmolarity medium (Fig. 7e,f). Note also that the sensor was more nuclear in cells grown in 1 M sorbitol, implying that the basal activity of the pathway decreased under these conditions and that the deletion of Ste11 also influenced this basal activity in hyper-osmotic medium.

Single cell response to cell wall damage

Because of the wide variety in basal activity of Mpk1 observed in the cell population, we wondered how individual cells responded to zymolyase treatment. Figure 8a represents a 2D-map of the normalized response of more than 300 single cells sorted based on their final response. Using a threshold of 0.2 for the final response, we can split the population in a group of responding (58 %, blue) and non-responding cells (green). Figure 8b displays the average nuclear-to-cytoplasmic ratio of the sensor as function of time for these two populations. The non-responding cells have a strikingly lower level of sensor nuclear enrichment at the onset of the experiment denoting a higher basal activity of the pathway in these cells (Fig. 8c).

Single cell responses upon zymolyase-induced cell wall damage. une Heat map of the response of individual cells bearing the SKARS Mkk2DS1-100-NLS-RFP to zymolyase (3 U/mL). Each line represents the normalized response of one single cell (Nc = 313). The cell traces were sorted based on the level of final response. This measurement was used to classify the cells in a group of responding cells (blue) and a group of non-responding cells (green). The basal level of each trace is indicated in shades of red (from black to red, increasing basal level). These cells also bear the cell cycle marker Whi5 and its level of nuclear enrichment is indicated in shades of yellow (from black to yellow, increasing nuclear Whi5). b Average nuclear-to-cytoplasmic ratio as function of time for the responding and non-responding cells. c Histogram of the basal level in responding and non-responding cells. d, e Histogram of the final response measured in cells with or without nuclear enrichment of the cell-cycle marker Whi5 () or Yox1 (e).

Since it has been reported that the activity of the Mpk1 pathway fluctuates during the cell cycle and is higher in phases of polarized growth, we wondered whether the heterogeneity observed in the response to zymolyase was dependent on cell cycle stage [33]. G1 cells in the population were identified with a Whi5-mCitrine tag. The level of nuclear accumulation of Whi5 for each cell is shown in Figure 8a cells with nuclear Whi5 can be found in both the responding and non-responding cells. Figure 8d compares the final response of cells with nuclear and cytoplasmic Whi5. A similar analysis was performed with Yox1-mCitrine cells, where the presence of the fluorescent protein in the nucleus identifies S-phase and early G2-phase cells. There was a tendency for G1 cells to respond stronger to the stimulus while dividing cells displayed a decreased tendency to respond. However, there was no apparent inhibition of CWI signaling in a cell cycle-dependent manner.

To modulate the basal activity of the pathway, we grew cells in low glucose (0.01 %, Additional file 1: Figure S8). In this medium, the growth rate was slower, thus remodelling of the cell wall occurred on longer time-scales, resulting in a lower constitutive basal activity of Mpk1. Indeed, we observed a global increase in the basal nuclear enrichment of the sensor, resulting from the decreased activity of Mpk1 (Additional file 1: Figure S8B). A larger fraction of the cells stressed with zymolyase under these conditions displayed an export of the sensor (Additional file 1: Figure S8C). Together, these results indicate that basal activity of the CWI pathway is linked with cell growth rather than the cell cycle. Moreover, in cells where Mpk1 is already activated by growth, we do not detect an additional effect due to the cell wall stress induced by zymolyase within the time-frame of the experiment.


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