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Complémentarité de l'ADNc


Au sens strict, quelle est la définition de l'ADNc ? Cela me confond, car on dit généralement qu'il fait référence à l'ADN complémentaire de l'ARNm. Est-ce correct? Est-il limité à l'ARNm mature ?

Je trouve aussi la directionnalité très déroutante. Si je comprends bien, l'ARNm a une séquence équivalente (moins d'introns, après épissage) au soi-disant «brin codant» de l'ADN. Cela signifie-t-il que l'ADNc fabriqué à partir d'ARNm, au moins avant traité avec une ADN polymérase, est également complémentaire de l'ADN génomique d'origine ? Est-ce la meilleure définition (j'ai vu cela aussi utilisé, bien que la première définition semble beaucoup plus courante).

Enfin, si je comprends bien, chaque chromosome a un brin avant et un brin inverse, définis par convention, mais le brin «codant» d'un gène donné est aléatoire. Cela semble contre-intuitif… est-ce juste parce que les deux volets sont équivalents ? Introduit-il des complications en termes de « savoir » cellulaire quel brin est le brin codant pour un gène ?

La réponse la plus positive à cette question (http://www.biostars.org/p/3423/) m'a encore plus confuse. Je ressens la même chose que 'Onefishtwofish', dans les réponses. Quelqu'un peut-il clarifier?


C'est une bonne question et cela m'a aussi troublé.

Une définition standard de l'ADNc est qu'il s'agit d'un produit double brin (ds) d'ARNm mature. Je suppose qu'il est possible de copier un brin d'ARN naissant dans l'ADNc, mais je n'ai jamais entendu parler de cela.

Parce que l'ADNc est un ADNdb, le brin d'origine est fabriqué à partir de votre ARNm en tant que brin complémentaire, mais vous vous débarrassez ensuite de l'ARN et créez le deuxième brin pour obtenir une molécule stable et reproductible. La molécule totale d'ADNdb est ce que nous appelons ADNc (pas un seul brin de ce matériau).

considérez cette molécule d'ADN simplifiée :

ATG-INTRON-CTCTAG

TAC-INTRON-GAGATC

cela pourrait être transcrit dans l'ARNm suivant (correspondant à Met-INTRON-Leu-Stop) :

AUG-INTRON-CUCUAG

avant l'exportation nucléaire, l'intron est retiré, ce qui rend l'ARNm mature :

AUGCUCUAG

tu fais de l'ADNc à partir de ça :

ATGCTCTAG

TACGAGATC

Ainsi, vous avez à la fois un brin codant et un brin complémentaire dans votre ADNc.

En ce qui concerne la directionnalité sur le chromosome, les gènes peuvent être dans les deux sens (ce qui signifie qu'ils peuvent utiliser l'un ou l'autre brin comme brin codant), mais n'oubliez pas que les forces qui contribuent à la transcription sont simplement déterminées localement (assemblage de facteurs de transcription, etc.) aucune attention à la direction dans laquelle ils vont ou au brin où ils se trouvent par rapport à tout autre gène. Les brins sont étiquetés comme positifs et négatifs, mais c'est juste une référence pour l'orientation. Un bon endroit pour parcourir le génome humain (ou d'autres espèces) est la visionneuse de carte du NIH. Cliquez sur un chromosome pour voir les gènes qui lui sont associés. Notez que la colonne intitulée « O » est pour l'orientation.


3.6 : ADNc

  • Contribution de Ross Hardison
  • Professeur T. Ming Chu (biochimie et biologie moléculaire) à la Pennsylvania State University

Les clones d'ADNc sont des copies d'ARNm

La construction de clones d'ADNc implique la synthèse d'ADN complémentaire à partir d'ARNm, puis l'insertion d'une copie duplex de celui-ci dans un vecteur de clonage, suivie de la transformation de bactéries (Figure (PageIndex<1>)).

Figure (PageIndex<1>) : Création de clones d'ADNc

une. Synthèse du premier brin: Tout d'abord, on recuit une amorce oligo dT sur la queue polyA 3' d'une population d'ARNm. Puis transcriptase inverse commencera la synthèse d'ADN à l'amorce, en utilisant les dNTP fournis dans la réaction, et copiera l'ARNm dans ADN complémentaire, abrégé ADNc. L'ARNm est dégradé par l'activité RNase H associée à la transcriptase inverse et par un traitement ultérieur avec un alcali.

b. Synthèse du deuxième brin: Pour que l'amorce fasse le deuxième brin d'ADN (équivalent en séquence à l'ARNm d'origine), on peut utiliser une épingle à cheveux transitoire à la fin de l'ADNc. (La base de sa formation n'est pas certaine.) Dans d'autres schémas, on génère un site de liaison à l'amorce et on utilise une amorce dirigée vers ce site. Une façon de le faire est par la queue homopolymère de l'ADNc suivie par l'utilisation d'une amorce complémentaire. Des amorces aléatoires peuvent également être utilisées pour la synthèse du second brin bien que cela empêche la génération d'un ADNc complet (c'est-à-dire une copie de l'ARNm entier). Cependant, il est rare de générer des copies duplex de l'ARNm entier par quelque moyen que ce soit.

L'ADN polymérase (par exemple la polymérase de Klenow) est utilisée pour synthétiser le deuxième brin, complémentaire de l'ADNc. Le produit est ADNc duplex.

Si l'épingle à cheveux a été utilisée pour amorcer la synthèse du deuxième brin, elle doit être ouverte par une nucléase spécifique à un seul brin telle que S1.

c. Insertion de l'ADNc duplex dans un vecteur de clonage :

Une méthode consiste à utiliser désoxynucléotidyl transférase terminale ajouter un homopolymère tel que poly-dC aux extrémités de l'ADNc duplex et un homopolymère complémentaire tel que poly-dG au vecteur.

Une approche alternative consiste à utiliser liens ceux-ci peuvent être utilisés de telle sorte qu'un lieur portant un site de clivage pour une endonucléase de restriction soit à l'extrémité 5' de l'ADNc duplex et qu'un lieur portant un site de clivage pour une endonucléase de restriction différente soit à l'extrémité 3'. (Dans ce contexte, 5 & rsquo et 3 & rsquo font référence au non-modèle, ou au brin " top ".) Cela permet un clonage " forcé " dans le vecteur, et on a des informations initiales sur l'orientation, en fonction de la proximité d'un site de clivage ou de l'autre.

L'ADNc et le vecteur sont joints aux extrémités, à l'aide d'ADN ligase, pour former plasmides d'ADNc recombinants (ou phage).

ré. Les plasmides d'ADNc ligaturés sont ensuite transformé en E. coli. L'ensemble résultant de transformants est un une bibliothèque de clones d'ADNc.


ADN recombinant et biotechnologie

ADN complémentaire

L'ADN complémentaire (ADNc) est synthétisé en laboratoire à partir d'ARN messager (Fig. 18-3). L'ADNc n'est pas de l'ADN génomique, car le transcrit de l'ARN génomique a été traité (c'est-à-dire qu'il manque de promoteurs et d'introns). L'enzyme transcriptase inverse (voir chapitre 15) est utilisée pour synthétiser l'ADN double brin qui est une copie complémentaire de l'ARNm. L'ajout de séquences de liaison à l'extrémité de cet ADN, qui contiennent le site de restriction, suivi d'un traitement avec une enzyme de restriction, produit une préparation d'ADNc avec des extrémités cohésives prêtes à être insérées dans un vecteur. Une préparation d'ADNc représente les gènes qui étaient activement exprimés dans une cellule, un organe ou un organisme entier au moment de la récolte et est appelée banque d'ADNc.


Bibliothèques d'ADN génomique

Taille de certains génomes et chromosomes :

  • Le génome humain contient environ 50 000 gènes uniques dans 3 à 4 milliards de paires de bases d'ADN, dispersés dans 23 paires de chromosomes.

Fragmentation de l'ADN génomique pour la construction de bibliothèques

Digestion par endonucléase de restriction

  • Un six-cutter (par exemple Eco RI) coupera en moyenne tous les 4,1 Ko. La digestion complète de l'ADN humain avec ce type d'enzyme donnera environ 1 x 10 6 fragments uniques.
  • Quelle est la probabilité de trouver un clone dans une bibliothèque donnée ?

La probabilité exacte d'avoir une séquence d'ADN donnée dans la bibliothèque peut être calculée à partir de l'équation

N = ln(1 -P)/ln(1 - f) P est la probabilité désirée F est la proportion fractionnaire du génome dans un seul recombinant N est le nombre nécessaire de recombinants

Par exemple, de quelle taille de bibliothèque (c.

N = ln(1 - 0,99)/ln(1 - (4096/3x10 9 )) N = 3,37 x 10 6 clones

Ainsi, à partir de ce type d'analyse, nous pouvons voir que nous avons besoin d'une technologie qui nous permettra d'atteindre ce qui suit :

  1. Insertion stable de fragments d'ADN relativement volumineux dans notre vecteur de clonage
  2. Haute efficacité d'insertion et capacité à gérer un grand nombre de clones
  • Par exemple, lors du placage E. coli colonies sur une plaque de Petri 3", la densité maximale pratique pour permettre l'isolement des colonies individuelles est d'environ 100-200 colonies par plaque.
  • Si nous devions essayer de plaquer notre bibliothèque de 3,37 x 10 6 de cette manière, il faudrait environ 22 500 plaques.
  • Non seulement cela, mais de si gros fragments d'ADN ne sont pas bien tolérés dans les E. coli des vecteurs de clonage tels que pBR322.

Les vecteurs bactériophages lambda sont couramment utilisés pour la construction de bibliothèques génomiques

Le bactériophage l est un E. coli phage avec un type de particule de phage icosaédrique qui contient le génome viral :

Graphique 3.6.6 : Bactériophase je

  • Au cours de la réplication, l'ADN du phage est produit sous une forme concatémère, qui est clivé par des endonucléases appropriées pour permettre l'empaquetage d'un seul génome dans la capside du phage.
  • Il a été découvert que les régions internes du génome du phage, qui n'étaient pas essentielles à la réplication du phage, pouvaient être supprimées et remplacées par de l'ADN d'intérêt.
  • Cet ADN hybride pourrait être efficacement emballé et former un phage infectieux.

Graphique 3.6.7 :Création de phage inefficace

Les avantages de ce type de système par rapport aux plasmides comme pBR322 sont :

  1. Le génome du phage est capable de s'empaqueter efficacement avec des inserts d'ADN aussi grands que 20 Kb.
  2. De plus, les phages emballés sont hautement infectieux et infectent E. coli avec une efficacité beaucoup plus élevée que les méthodes de transformation de plasmides..

La digestion incomplète de l'ADN génomique permettra l'identification des chevauchements de séquences

Une digestion complète avec une endonucléase donnera une bibliothèque contenant pas de fragments qui se chevauchent:

Cependant, digestion incomplète se traduira par une bibliothèque contenant des fragments qui se chevauchent :

  • Ainsi, les informations de séquence obtenues à partir de un clone permettra d'isoler des clones contenant informations sur les séquences voisines (qui se chevauchent).
  • Cela peut permettre d'obtenir de grandes étendues contiguës d'informations de séquence (" Chromosome Walking ").

Bibliothèques de sondage

Une fois qu'une banque (ADNc ou génomique) a été construite, nous voulons être en mesure d'identifier les clones qui contiennent l'ADN d'intérêt.

  • Par exemple, à partir des informations sur les séquences protéiques, nous pouvons déduire les étirements possibles de la séquence d'ADN correspondante (il y aura cependant une ambiguïté due à la dégénérescence des codons).
  • Si nous pouvons synthétiser un oligonucléotide complémentaire à notre séquence d'ADN d'intérêt, nous pouvons l'utiliser pour nous hybrider spécifiquement au clone approprié dans notre bibliothèque (c'est-à-dire pour sonde notre bibliothèque).

Dans les méthodologies standard, l'oligonucléotide est phosphorylé à l'extrémité 5' avec du g 32 P-ATP radiomarqué et T4 polynucléotide kinase.

  • La sonde est ensuite incubée avec des plaques de phage individuelles qui ont été fixées sur de la nitrocellulose et leur ADN dénaturé par traitement à la base.
  • Si la plaque contient de l'ADN complémentaire à la séquence de la sonde, la sonde s'hybridera.
  • Si la nitrocellulose (contenant de nombreuses plaques individuelles) est exposée à un film radiographique, seules les plaques avec la sonde hybridée apparaîtront (sous forme de tache sombre):

Graphique 3.6.8 :Plaque radiomarquée

Notez qu'il est important de garder une trace de l'orientation de la nitrocellulose par rapport au film radiographique (généralement de l'encre radioactive est utilisée pour identifier l'orientation de la nitrocellulose).

Faux positifs

Si nous concevons des sondes d'ADN à partir d'informations sur les séquences protéiques, nous aurons ambiguïté possible dans notre séquence d'ADN déduite utilisée pour la conception de la sonde.

  • Habituellement, les oligonucléotides 14-24mer sont utilisés comme sondes, une sonde 14-24mer signifie que nous avons besoin d'un tronçon de 5-8 acides aminés dans le polypeptide.
  • Étant donné le choix, les meilleures séquences d'acides aminés à rechercher dans un polypeptide sont celles avec faible dégénérescence des codons (voir au dessus).
  • Ainsi, nous chercherions une courte séquence de séquence polypeptidique contenant, espérons-le, Met ou Trp , et avec les acides aminés restants comprenant soit Phe, Tyr, His, Gln, Asn , Lys, Asp, Glu ou Cys .
  • Régions comprenant Leu, Arg ou Ser doivent être évité (6 codons chacun).

Au cours de la synthèse d'oligonucléotides, de multiples bases seront incorporées à des positions ambiguës.

  • Ainsi, notre sonde sera en fait un mélange d'oligonucléotides.
  • Plus la dégénérescence est élevée, plus la possibilité de "faux positifs" est grande, c'est-à-dire de clones qui s'hybrident mais ne sont pas liés à la séquence réelle que nous voulons.
  • Les clones positifs sont séquencés et la séquence d'acides aminés déduite est comparée à nos informations de séquence polypeptidique pour identifier les clones corrects.

Anticorps (Immunoglobulines)

Si le vecteur ou le phage particulier utilisé pour construire une banque d'ADNc contient un promoteur région en amont du site d'insertion, nous pouvons être en mesure de cribler les clones souhaités en recherchant expression de la protéine d'intérêt .

  • Dans ce cas, nous avons besoin d'un dosage qui soit à la fois sensible (nous ne produirons pas beaucoup de protéines) et spécifique (nous voulons minimiser les faux positifs).
  • L'un des meilleurs dosages, à la fois sensible et spécifique, utilise anticorps.

Antigène, anticorps, épitope

L'un des mécanismes de défense des vertébrés est la capacité de distinguer entre soi et pas soi molécules.

  • Ainsi, si une molécule étrangère (provenant d'une autre espèce ou parfois d'un autre individu au sein d'une espèce) envahit un organisme vertébré, le système immunitaire fonctionne pour apprendre à identifier cette molécule.
  • Lors d'invasions futures par la même molécule, l'organisme se défend contre elle en produisant des anticorps qui reconnaissent et se lient à l'étranger antigène.
  • Lorsque les anticorps se lient à l'antigène, certains globules blancs (macrophages et monocytes) reconnaissent le corps envahisseur comme étranger et réagissent en le détruisant.

Les anticorps sont des molécules en forme de « Y » qui contiennent deux chaînes lourdes identiques et deux chaînes légères identiques.

  • La tige du 'Y' comprend le Domaine Fc (constant) , et les « bras » du « Y » comprennent le Domaines Fab (variables) .
  • Les antigènes se lient au régions déterminant la complémentarité (CDR) situés aux extrémités des domaines Fab.

Graphique 3.6.9 :Structure d'anticorps

Les anticorps sont synthétisés par les lymphocytes B. Chaque lymphocyte B est capable de produire un seul type d'anticorps dirigé contre un déterminant structurel spécifique, ou épitope, sur un antigène.

  • Ainsi, une réponse immunitaire à un antigène protéique peut conduire à une population de lymphocytes B produisant chacun des anticorps qui reconnaissent un déterminant structurel différent de la protéine étrangère.
  • Un épitope peut être un région contiguë de 5 ou 6 acides aminés dans le polypeptide étranger, ou l'épitope peut comprendre une demi-douzaine environ d'acides aminés mis en juxtaposition dans la protéine native, encore largement espacés dans la séquence polypeptidique.
  • Ainsi, certains anticorps reconnaîtront les natifs et formes dénaturées d'une protéine étrangère tout aussi bien, tandis que d'autres anticorps peuvent ne reconnaître que l'un ou l'autre.

Si la protéine d'intérêt a été purifiée, elle peut être utilisée pour induire une réponse immunitaire chez un animal hôte .

  • Les animaux hôtes typiques comprennent la souris, le poulet, le lapin, la chèvre, le mouton, le cheval et occasionnellement l'homme.
  • Après une immunisation initiale, suivie d'une ou plusieurs injections de rappel, les lymphocytes B de l'animal hôte peuvent produire des anticorps dirigés contre l'antigène.
  • Les anticorps peuvent être purifiés à partir d'échantillons de sang prélevés sur l'animal. De telles préparations d'anticorps sont dites polyclonal.
  • Cela fait référence au fait que les anticorps présents proviennent d'une collection de différents lymphocytes B et reconnaîtront ainsi un variété d'épitopes différents sur la protéine antigénique.
  • La capacité d'isoler des anticorps à partir d'échantillons de sang signifie que l'animal hôte n'a pas besoin d'être détruit.
  • Bien sûr, la taille de l'animal détermine la quantité d'anticorps que l'on peut obtenir. Par exemple, un lapin peut fournir 5 ml de sang toutes les deux semaines, une souris en fournit nettement moins, tandis qu'un cheval peut en fournir un peu plus.

Un anticorps isolé d'un population de lymphocytes B uniques est appelé monoclonal.

  • Il reconnaît un épitope unique sur la protéine antigénique.
  • Les lymphocytes B producteurs d'anticorps peuvent être isolés de la rate ou des ganglions lymphatiques. Cependant, ils ont un vie finieenvergureen culture, c'est-à-dire qu'elles vont subir un certain nombre de divisions cellulaires puis mourir.
  • Ces cellules peuvent cependant être fusionnées avec des lymphocytes immortels (myélome cancéreux) pour produire un hybridome cellule.
  • Une telle cellule est immortel comme le myélome, et produit un anticorps spécifique à partir du lymphocyte B. La capacité de croître indéfiniment en culture permet d'isoler des quantités utiles de des anticorps monoclonaux.

Parfois, l'immunisation avec la protéine d'intérêt est problématique : des quantités appropriées de matériel purifié ne peuvent pas être produites, ou la protéine est elle-même toxique au niveau de dosage nécessaire pour produire une réponse immunitaire.

  • Si une information de séquence partielle est connue, alors de grandes quantités de polypeptides représentant de courts fragments de la protéine peuvent être synthétisées et utilisées pour immuniser l'animal.
  • Souvent, ces polypeptides sont liés de manière covalente à une protéine porteuse (typiquement de l'albumine sérique) pour renforcer la réponse antigénique.
  • Les anticorps produits contre de tels peptides reconnaîtront uniquement les épitopes à l'intérieur du polypeptide. Ainsi, même les anticorps polyclonaux seraient assez limités dans leur reconnaissance d'épitope.

Comme avec les oligonucléotides radiomarqués, des anticorps peuvent être utilisés pour identifier des clones de bibliothèque qui contiennent un ADNc d'intérêt. Cette méthode reposerait bien entendu sur un hôte vecteur ou phage qui contient un promoteur en amont du site d'insertion de l'ADN génomique.


ADN complémentaire (ADNc)

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Ensuite, nous devons convertir l'ARN en ADN. Nous utilisons une enzyme appelée "transcriptase inverse" pour créer une séquence d'ADN complémentaire (ADNc) à partir du fragment d'ARN. Cela crée des molécules hybrides qui sont une combinaison d'ARN et d'ADNc.

ADNc. L'ARNm est isolé à partir d'un organisme d'intérêt. La partie simple brin de la boucle est coupée avec une nucléase S1 et le résultat est une copie d'ADNc double brin de l'ARNm. Notez que cet ADNc n'inclura que les portions d'exon du gène, et non les introns, qui ont été épissés hors de la matrice d'ARNm.


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Les échantillons d'ADNc de BioChain sont synthétisés en utilisant l'isolement d'ARN total dans l'installation avec des techniques modifiées pour assurer la cohérence. L'ADNc subit à la fois une inspection visuelle détectant des bandes intactes d'ADN ribosomique et un test de pureté avec un spectrophotomètre. Le premier brin est synthétisé en utilisant la transcriptase inverse MMLV à faible activité RNase H, avec une amorce oligo dT pour assurer la présence de l'intégralité de l'ADNc.

Les sources proviennent d'une variété de matières animales, végétales et humaines/fœtales (y compris des organes sains et malades). La documentation sur l'histoire clinique des tissus est disponible. L'ADNc peut être utilisé pour la PCR, la découverte de gènes, l'analyse ou l'ARNm et le clonage, entre autres.


Étape 1. Préparer l'échantillon

L'ARN sert de matrice dans la synthèse d'ADNc. L'ARN total est couramment utilisé dans la synthèse d'ADNc pour des applications en aval telles que la RT-(q)PCR, tandis que des types spécifiques d'ARN (par exemple, l'ARN messager (ARNm) et les petits ARN tels que le miARN) peuvent être enrichis pour certaines applications comme la construction d'une bibliothèque d'ADNc et le profilage des miARN.

Le maintien de l'intégrité de l'ARN est essentiel et nécessite des précautions particulières lors de l'extraction, du traitement, du stockage et de l'utilisation expérimentale. Les meilleures pratiques pour empêcher la dégradation de l'ARN comprennent le port de gants, le pipetage avec des embouts à barrière d'aérosol, l'utilisation de matériel de laboratoire et de réactifs sans nucléase, et la décontamination des zones de travail.

Pour isoler et purifier l'ARN, diverses stratégies sont disponibles en fonction du type de matériel source (par exemple, sang, tissus, cellules, plantes) et des objectifs des expériences. Les principaux objectifs des flux de travail d'isolement sont de stabiliser les molécules d'ARN, d'inhiber les RNases et de maximiser le rendement avec des méthodes de stockage et d'extraction appropriées. Les méthodes de purification optimales éliminent les composés endogènes, tels que les polysaccharides complexes et l'acide humique des tissus végétaux qui interfèrent avec l'activité enzymatique et les inhibiteurs courants des transcriptases inverses, tels que les sels, les ions métalliques, l'éthanol et le phénol. Une fois purifié, l'ARN doit être conservé à -80°C avec des cycles de congélation-dégel minimaux.

Points forts du produit

Des conseils de dépannage

  1. Minimiser le nombre de cycles de gel-dégel des échantillons d'ARN pour éviter la dégradation.
  2. Stockez l'ARN dans une solution tamponnée à l'EDTA pour minimiser le clivage non spécifique par les nucléases qui ont des cofacteurs d'ions métalliques.
  3. Utiliser de l'eau certifiée sans nucléase ou traitée au DEPC (diéthylpyrocarbonate) pour garantir l'absence de RNase.
  4. Évaluer l'intégrité de l'ARN par électrophorèse sur gel ou microfluidique.

Prévalence

Des transcriptases inverses ont été identifiées dans de nombreux organismes, notamment des virus, des bactéries, des animaux et des plantes. Dans ces organismes, le rôle général de la transcriptase inverse est de convertir des séquences d'ARN en séquences d'ADNc capables de s'insérer dans différentes zones du génome. De cette manière, la transcription inverse contribue à (Figure 2):

  • Propagation de rétrovirus, par exemple le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), le virus de la leucémie murine de Moloney (M-MuLV) et le virus de la myéloblastose aviaire (AMV) [1,2]
  • Diversité génétique chez les eucaryotes via des éléments mobiles transposables appelés rétrotransposons [4]
  • Réplication des extrémités chromosomiques appelées télomères [5,6]
  • Synthèse d'éléments chimériques d'ADN/ARN extrachromosomiques appelés ADN monocaténaire multicopie (ADNms) chez les bactéries [7,8]

Figure 2. Rôles de la transcriptase inverse dans les systèmes biologiques. (UNE) L'ARN viral est rétro-transcrit pour être intégré dans le génome de l'hôte. (B) En rétrotransposition, un intermédiaire d'ARN est rétro-transcrit pour insérer des copies d'ADN dans d'autres zones du génome. (C) La transcriptase inverse de la télomérase (TERT) utilise l'ARN comme matrice pour allonger et maintenir les extrémités des chromosomes eucaryotes. () La transcription inverse est une étape intermédiaire dans la formation d'ADN monocaténaire multicopie (ADNms) chez les bactéries.


Complémentarité de l'ADNc - Biologie

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Presque toutes les cellules du corps ont le même ADN, mais différents types de cellules, tels que les neurones et les cellules musculaires, expriment des gènes différents car seuls certains gènes sont transcrits en ARN messager, ou ARNm, dans chaque cellule. En laboratoire, les ARNm peuvent être utilisés comme matrice pour synthétiser l'ADN complémentaire, l'ADNc, afin d'étudier l'expression des gènes. Une méthode courante consiste à extraire l'ARN des cellules, puis à isoler l'ARNm d'autres types d'ARN, comme l'ARN ribosomique ou l'ARN de transfert, en faisant passer l'échantillon sur une colonne de billes avec des segments de nucléotides de thymine attachés.

Ceux-ci se lient à la queue poly-A, une chaîne de nucléotides d'adénine spécifiquement présents sur les extrémités 3-prime de l'ARNm eucaryote. Les autres types d'ARN ne se lient pas et sont emportés.

Une fois l'ARNm isolé, une amorce poly-T est liée à la queue poly-A, fournissant un point de départ aux enzymes de la transcriptase inverse pour transcrire un ADNc simple brin à partir de l'ARNm. Des produits chimiques, tels que les enzymes RNase, sont ensuite ajoutés pour dégrader l'ARN.

Les enzymes ADN polymérase sont ensuite utilisées pour synthétiser un brin complémentaire de l'ADNc, ce qui donne un ADNc double brin, qui peut être inséré dans un vecteur bactérien ou viral et utilisé dans la recherche en biologie moléculaire.

15.13 : ADN complémentaire

Aperçu

Seuls les gènes transcrits en ARN messager (ARNm) sont actifs ou exprimés. Les scientifiques peuvent donc extraire l'ARNm des cellules pour étudier l'expression des gènes dans différentes cellules et tissus. Le scientifique convertit l'ARNm en ADN complémentaire (ADNc) via la transcription inverse. Étant donné que l'ARNm ne contient pas d'introns (régions non codantes) et d'autres séquences régulatrices, l'ADNc&mdashunlike genomic DNA&mdash permet également aux chercheurs de déterminer directement la séquence d'acides aminés du peptide codé par le gène.

Synthèse d'ADNc

L'ADNc peut être généré par plusieurs méthodes, mais une méthode courante consiste à extraire d'abord l'ARN total des cellules, puis à isoler l'ARNm des types les plus prédominants d'ARN de transfert (ARNt) et ribosomique (ARNr). L'ARNm eucaryote mature a une queue poly (A) et une chaîne de nucléotides d'adénine ajoutée à son extrémité 3, contrairement aux autres types d'ARN. Par conséquent, une chaîne de nucléotides de thymine (oligo-dT) peut être attachée à un substrat tel qu'une colonne ou des billes magnétiques, pour s'apparier spécifiquement avec les queues poly(A) de l'ARNm. Alors que l'ARNm avec une queue poly(A) est capturé, les autres types d'ARN sont emportés.

Ensuite, la transcriptase inverse et l'enzyme ADN polymérase mdasha des rétrovirus et mdashis utilisés pour générer l'ADNc à partir de l'ARNm. Étant donné que, comme la plupart des ADN polymérases, la transcriptase inverse ne peut ajouter des nucléotides qu'à l'extrémité 3&rsquo d'une chaîne, une amorce poly(T) est ajoutée pour se lier à la queue poly(A) afin de fournir un point de départ pour la synthèse d'ADNc. Le brin d'ADNc se termine par une boucle en épingle à cheveux. L'ARN est ensuite dégradé et généralement avec un traitement alcalin ou des enzymes RNase, laissant l'ADNc simple brin intact.

Un second brin d'ADN complémentaire de l'ADNc est ensuite synthétisé par l'ADN polymérase&mdashoften en utilisant la boucle en épingle à cheveux du premier brin d'ADNc ou un morceau coupé de l'ARNm comme amorce.

L'ADNc double brin résultant peut être inséré dans des vecteurs bactériens ou viraux et cloné en utilisant des techniques de biologie moléculaire standard. Une bibliothèque d'ADNc&mdashreprésentant tous les ARNm dans les cellules ou le tissu d'intérêt&mdash peut également être construite pour des recherches supplémentaires.

Pray, Leslie A. &ldquoLa révolution biotechnologique : PCR et utilisation de la transcriptase inverse pour cloner les gènes exprimés.&rdquo Éducation à la nature 1, non. 1 (2008) : 94. [Source]


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