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Lors de l'amplification en pont de séquences d'ADN, pourquoi les séquences ne sont-elles pas amplifiées dans les deux orientations ?


Pendant l'amplification du pont, lorsque les séquences attachées aux adaptateurs sur la surface forment des "ponts" et sont répliquées, il semble que des séquences avec l'une ou l'autre extrémité attachée à la surface seront créées. Par exemple, dans ce lien de la figure 7, il y a des séquences dans les deux sens sur la plaque. A l'étape 8, toutes les séquences sont orientées dans le même sens (extrémité rose attachée à la surface) Comment cela se passe-t-il ? Comment les autres séquences sont-elles supprimées ?


Consultez ce document sur le fonctionnement du séquençage Illumina.

Lorsque vous effectuez un séquençage à une seule extrémité, les brins inverses produits après l'amplification du pont + dénaturation (étape-7) sont spécifiquement supprimés (écrêtés à la jonction de l'amorce et de la région "insert"). De plus, les extrémités 3' libres sont bloquées (par modification chimique) pour s'assurer qu'il n'y a pas d'amorçage indésirable.

Pour le séquençage d'extrémités appariées, les deux brins sont séquencés ; ainsi, dans une Flow Cell, le brin avant est clivé tandis que dans l'autre, le brin inverse est clivé.


Vraisemblablement, ils ont retiré un ensemble de fragments de leurs figures pour la clarté de la démonstration. En réalité, les deux fragments restent immobilisés sur la puce. L'amorce de séquençage ne s'hybride qu'à un seul adaptateur, ce qui permet une extension sélective de l'un des ensembles dans chaque série. Pour les fragments de longueur suffisante, cela fournit un mécanisme simple pour créer des lectures de séquences de fin appariées car vous pouvez utiliser une amorce pour lire un brin et, par la suite, une autre amorce pour lire l'autre brin.


Lors de l'amplification en pont de séquences d'ADN, pourquoi les séquences ne sont-elles pas amplifiées dans les deux orientations ? - La biologie

Avec l'avènement des technologies génomiques, les régions génomiques d'amplification récurrente dans les tumeurs ont été cartographiées dans tout le génome humain. Les mécanismes sous-jacents à une telle récidive sont d'un grand intérêt.

Deux mécanismes, les cycles de rupture-fusion-pont (BFB) et la formation de chromosomes à double minute (DM), ont été et continuent d'être au centre du sujet au cours des trois dernières décennies. Une caractéristique commune de ces mécanismes est que, une fois le processus lancé, le gain de nombre de copies supplémentaire est rationalisé.

Les cycles BFB peuvent être initiés par la fusion de télomères extrêmement courts et de cassures d'ADN. Une source importante de cassures de l'ADN est le stress de réplication.

Les DM peuvent être à la fois d'origine mono-locus et multi-locus. La chromothripsie et la réparation erronée de l'ADN sont un mécanisme sous-jacent probable.

Les implications des cycles BFB et des DM dans la prise en charge des patients cancéreux ont récemment émergé.

Les augmentations focales du nombre de copies (amplification génomique) identifient les gènes pilotes oncogènes et les cibles thérapeutiques dans les génomes cancéreux. Avec l'avènement des technologies génomiques, l'amplification génomique récurrente a été cartographiée dans tout le génome. L'amplification récurrente pourrait être uniquement due à une sélection positive pour les effets de promotion des tumeurs des produits géniques amplifiés. Alternativement, la récurrence pourrait résulter de la susceptibilité des loci à l'amplification. Distinguer ces possibilités nécessite une parfaite compréhension des mécanismes d'amplification. Deux mécanismes, la formation de chromosomes double minute (DM) et les cycles de rupture-fusion-pont (BFB), ont été liés à plusieurs reprises à l'amplification génomique, et l'impact des deux mécanismes a été confirmé dans les données de génomique du cancer. Nous passons en revue les détails de ces mécanismes et discutons des mécanismes sous-jacents à la récidive.


RÉSUMÉ DE L'INVENTION

Selon un aspect de l'invention, un procédé analyse des séquences d'acide nucléique. Une séquence d'acide nucléique à identifiant unique (UID) est attachée à une première extrémité de chacun d'une pluralité de fragments d'acide nucléique d'analyte pour former des fragments d'acide nucléique d'analyte identifiés de manière unique. La séquence nucléotidique d'un fragment d'acide nucléique d'analyte identifié de manière unique est déterminée de manière redondante, les séquences nucléotidiques déterminées qui partagent un UID formant une famille de membres. Une séquence nucléotidique est identifiée comme représentant avec précision un fragment d'acide nucléique analyte lorsqu'au moins 1 % des membres de la famille contiennent la séquence.

Selon un autre aspect de l'invention, un procédé analyse des séquences d'acides nucléiques. Une séquence d'identification unique (UID) est attachée à une première extrémité de chacun d'une pluralité de fragments d'ADN d'analyte en utilisant au moins deux cycles d'amplification avec des première et seconde amorces pour former des fragments d'ADN d'analyte identifiés de manière unique. Les UID sont en excès par rapport aux fragments d'ADN de l'analyte pendant l'amplification. Les premières amorces comprennent un premier segment complémentaire d'un amplicon souhaité, un deuxième segment contenant l'UID et un troisième segment contenant un site d'amorçage universel pour une amplification ultérieure. Les secondes amorces comprennent un site d'amorçage universel pour une amplification ultérieure. Chaque cycle d'amplification attache un site d'amorçage universel à un brin. Les fragments d'ADN d'analyte identifiés de manière unique sont amplifiés pour former une famille de fragments d'ADN d'analyte identifiés de manière unique à partir de chaque fragment d'ADN d'analyte identifié de manière unique. Des séquences nucléotidiques d'une pluralité de membres de la famille sont déterminées.

Un autre aspect de l'invention est un procédé pour analyser l'ADN en utilisant des séquences d'identification unique (UID) endogènes. On obtient de l'ADN d'analyte fragmenté comprenant des fragments de 30 à 2000 bases, inclus. Chaque extrémité d'un fragment forme un UID endogène pour le fragment. Des oligonucléotides adaptateurs sont attachés aux extrémités des fragments pour former des fragments adaptés. Des fragments représentant un ou plusieurs gènes sélectionnés sont éventuellement enrichis au moyen de la capture d'un sous-ensemble des fragments à l'aide d'oligonucléotides de capture complémentaires de gènes sélectionnés dans l'ADN d'analyte ou en amplifiant des fragments complémentaires de gènes sélectionnés. Les fragments adaptés sont amplifiés à l'aide d'amorces complémentaires des oligonucléotides adaptateurs pour former des familles de fragments adaptés. La séquence nucléotidique est déterminée à partir d'une pluralité de membres d'une famille. Les séquences nucléotidiques de la pluralité de membres de la famille sont comparées. Une séquence nucléotidique est identifiée comme représentant avec précision un fragment d'ADN d'analyte lorsqu'au moins 1 % des membres de la famille contiennent la séquence.

Encore un autre aspect de l'invention est une composition comprenant une population de paires d'amorces, dans laquelle chaque paire comprend une première et une seconde amorces pour amplifier et identifier un gène ou une portion de gène. La première amorce comprend une première portion de 10 à 100 nucléotides complémentaires du gène ou de la portion de gène et une seconde portion de 10 à 100 nucléotides comprenant un site d'hybridation à une troisième amorce. La seconde amorce comprend une première portion de 10 à 100 nucléotides complémentaires du gène ou de la portion de gène et une seconde portion de 10 à 100 nucléotides comprenant un site d'hybridation à une quatrième amorce. Interposée entre la première portion et la deuxième portion de la deuxième amorce se trouve une troisième portion constituée de 2 à 4000 nucléotides formant un identifiant unique (UID). Les identifiants uniques dans la population ont au moins 4 séquences différentes. Les première et deuxième amorces sont complémentaires des brins opposés du gène ou de la portion de gène. Un kit peut comprendre la population d'amorces et les troisième et quatrième amorces complémentaires des deuxièmes portions de chacune des première et deuxième amorces.

Ces modes de réalisation et d'autres qui apparaîtront à l'homme de l'art à la lecture de la description fournissent à l'art des outils et des procédés pour déterminer de manière sensible et précise des caractéristiques ou des séquences d'acide nucléique.


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RÉSULTATS

Génération de structures amplifiées par des plasmides contenant un IR de mammifère.

Nous avons montré précédemment, en utilisant les IR de l'une ou l'autre DHFR ou c-myc loci, que les plasmides avec un IR de mammifère et un MAR initient un processus similaire à l'amplification génique (17) . Nous fournissons maintenant la preuve qu'un processus similaire se produit en utilisant un troisième IR. p6XNβ a une région génomique de 7,8 kpb de la - humaineglobine locus qui contient un IR et une région avec une activité MAR (19) . Nous avons transfecté ce plasmide dans des cellules humaines COLO 320DM et préparé un étalement de métaphase à partir des transformants stables regroupés, à >4 semaines après la transfection. La localisation de la séquence plasmidique a été examinée par FISH en utilisant une sonde plasmidique. Dans 43 % (17 sur 40) ou 78 % (31 sur 40) des métaphases examinées, les signaux d'hybridation ont été détectés au niveau des DM ou au niveau de la HSR chromosomique, respectivement. Des images représentatives sont montrées dans la Fig. 1, UNE et B . En revanche, dans la métaphase dérivée de cellules transfectées avec le plasmide vecteur (p6XN), les signaux aux DM étaient à peine détectables (3 % 1 des 35 métaphases examinées) et aucun signal n'apparaissait au HSR (0 % 0 des 40 métaphases examinées). Par hybridation simultanée de la sonde plasmidique et du c-myc sonde cosmidique qui détecte un amplicon original dans COLO 320DM, nous avons précédemment montré que les plasmides amplifiés étaient soit intégrés dans des DM préexistants, généraient des DM indépendants ou généraient un HSR indépendant de l'amplicon original (17). Ces structures distinctes peuvent apparaître simultanément dans une même cellule. En plus de ces structures, nous avons trouvé des chromosomes en anneau extraordinairement grands (Fig. 1E) ⇓ . Bien que la fréquence de cette structure était faible, sa signification est discutée dans une section ultérieure. Les HSR ou les DM contenant les séquences plasmidiques transfectées étaient stables une fois qu'elles ont été générées, et elles ont persisté dans les cellules après >1 mois sans sélection de médicament.

Structure moléculaire de la région amplifiée.

Nous avons obtenu 16 clones indépendants de cellules COLO 320DM transformées de manière stable avec pSFVdhfr. L'analyse par FISH a conduit à l'identification de clones dans lesquels le plasmide était localisé soit dans les DM (10 clones), soit dans le HSR (3 clones), soit dans les deux (3 clones). Parmi ceux-ci, nous avons par la suite utilisé les clones numéros 12 (Fig. 1C) et 14 en tant que clones montrant l'intégration DM (clones DM) et le clone 22 (Fig. 1) et 24 comme montrant la formation de HSR (clones HSR).

L'ADN génomique de haut poids moléculaire isolé de ces clones a été traité avec une enzyme de restriction, et les produits analysés par hybridation Southern blot (Fig. 2, B et C) ⇓ . Initialement, nous avons observé que le nombre de copies de séquences plasmidiques était étonnamment élevé. Sur la base de l'intensité du signal, nous avons estimé le nombre de copies à 2000-4000 copies/cellule pour les clones DM ou à plus de 10 000 copies/cellule pour les clones HSR. Deuxièmement, nous avons observé que les bandes obtenues à partir de digestions génomiques étaient étonnamment nettes, en particulier pour les clones DM (clones 12 et 14). A une exception près, chaque fragment correspondait bien à un fragment généré à partir de pSFVdhfr circulaire qui avait été soumis à une procédure de digestion similaire. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant 6 clones indépendants de cellules COLO 320DM transformées avec pNeo.Myc-2.4 (données non présentées). L'analyse FISH des cellules fixées au PFA a toujours indiqué que la majorité des séquences plasmidiques se trouvaient dans la région amplifiée (données non présentées). Cela impliquait que les séquences plasmidiques devaient être amplifiées dans un réseau hautement ordonné, en particulier dans les DM. De plus, l'expérience de digestion unique a indiqué qu'il s'agissait d'un réseau en tandem tête-bêche. Bien que les mécanismes moléculaires restent à élucider, il a été démontré précédemment que les transgènes sont généralement arrangés sous forme de réseaux en tandem au sein d'un site d'intégration chromosomique (29) . Les résultats obtenus ici suggèrent que l'amplification de plasmides contenant IR peut également être médiée par un mécanisme similaire, vraisemblablement dans l'étape initiale de transformation. Cependant, il est remarquable que la répétition directe tête-à-queue reste intacte, même après l'amplification de quelques milliers de séquences plasmidiques. Cela suggère que l'intégration dans les DM a permis une forte augmentation du nombre de copies sans déstabiliser la séquence.

L'analyse par transfert de Southern du clone 12 a révélé un fragment inhabituel qui était censé refléter un produit de recombinaison (Fig. 2B ⇓ , astérisque). Par conséquent, nous avons utilisé une hybridation Southern, en utilisant plusieurs enzymes de restriction supplémentaires, pour identifier le point de recombinaison responsable de la génération de ce fragment (données non présentées). Cette analyse a révélé une recombinaison entre la région montrant une activité MAR dans DHFR et le Hyg gène dans une orientation directe. Ceci suggère que la rupture se produit à ces deux sites dans une répétition directe de plasmide et que ceci est suivi par la jonction de chaque extrémité. En utilisant une série d'amorces PCR qui entouraient le point de recombinaison (Fig. 2UNE) ⇓ et l'ADN génomique du clone 12, nous avons réalisé une PCR et soumis le produit le plus court (L3-R3) à un séquençage. La séquence que nous avons obtenue est représentée sur la figure 2 , ainsi que la séquence pSFVdhfr originale. Il n'y avait pas d'insertion de base à la jonction, ainsi qu'aucune homologie évidente entre les séquences recombinées, ce qui pourrait être interprété comme un produit de jonction d'extrémités non homologues. Un schéma de séquençage clair a été obtenu à partir du produit PCR, bien que l'ADN génomique de cellules portant plusieurs DM ait été utilisé comme matrice. Cela suggérait que les séquences recombinées dans les DM étaient stables pendant la propagation cellulaire.

Pour étudier la structure macroscopique de la région amplifiée, nous avons effectué FISH en utilisant une fibre de chromatine étirée (28). Des images représentatives sont montrées dans la Fig. 1, F et g . Comme c'est généralement le cas avec cette technique, le signal résultant ressemblait à un chapelet de perles. Les signaux vert et rouge, qui indiquent le vecteur et DHFR l'insert, respectivement, apparaissait presque alternativement dans chaque fibre où le signal d'hybridation spécifique apparaissait. Cela indiquait que les séquences plasmidiques amplifiées s'étendaient sans interruption. Nous avons estimé la longueur de répétition dans le clone 12 à quelques dizaines à 100 copies du plasmide/répétition d'origine sur la base de l'apparition de signaux verts et rouges alternés. Étant donné que les cellules du clone 12 contenaient ∼20-30 DM, l'intégration d'une à cinq copies de cette répétition dans les DM pourrait expliquer le nombre total de copies/cellule (2000-4000), qui a été obtenu à partir d'une analyse par transfert de Southern. Comme prévu, les séquences plasmidiques amplifiées couvraient une longueur beaucoup plus longue de la fibre préparée à partir du clone HSR 22 (Fig. 1g) ⇓ .

Pris ensemble, ces résultats suggèrent qu'une grande molécule circulaire composée de dizaines à des centaines de copies de plasmide se répétant directement s'est formée au stade initial de la transformation. Nous avons fréquemment observé le minuscule signal apparié parmi l'étalement en métaphase hybridé avec la sonde plasmidique, suggérant qu'il pourrait correspondre à un multimère plasmidique circulaire submicroscopique (données non présentées). Le multimère peut se recombiner avec des DM préexistants, se recombiner les uns avec les autres pour atteindre une taille similaire aux DM ou s'intégrer dans les chromosomes.

Analyse du processus initial de multimérisation par cotransfection.

Nous avons cotransfecté deux plasmides ayant un ADN IR et/ou -phage différent et examiné comment leurs structures amplifiées apparaissaient. Auparavant, il a été démontré que des séquences cotransfectées similaires ont subi une série de recombinaison intermoléculaire non homologue pour former une structure entremêlée, tôt après la transfection (30), cependant, leurs structures n'avaient pas été examinées par FISH. Nous avons préparé la propagation de la métaphase à partir de transformants stables à >4 semaines après la transfection et l'avons examinée par FISH bicolore qui détecte indépendamment les deux séquences transfectées. Les séquences cotransfectées ont toujours été détectées sous forme de mélange dans la structure amplifiée (Fig. 3, UNE et B) ⇓ . De plus, même l'ADN du phage était coamplifié s'il était cotransfecté avec un plasmide contenant IR.

Analyse de la structure amplifiée produite par cotransfection de plasmides ou d'ADN de phage. Des cellules COLO 320DM ont été cotransfectées avec un mélange d'ADN de (UNE) pSFVdhfr et pNeo.myc-2.4, (B et C) phage et pSFVdhfr, () pSFVdhfr et p6XNβ, (E) p6XNβ et pNeo.myc-2.4, et (F et g) pNeo.myc-2.4 et phage . Toutes les cultures ont été sélectionnées avec de la blasticidine. La propagation de la métaphase (UNE et B) ou fibre de chromatine (C–G) a été préparé à partir des transformants stables regroupés à >4 semaines après la transfection. La lame a été simultanément hybridée avec les sondes préparées à partir de l'insert d'ADN contenant chaque ADN IR ou phage, qui a été marqué à la biotine ou au DIG. L'hybridation croisée a été strictement contrôlée. La sonde hybridée a été détectée en vert (UNE, B, et , DHFR E,-globine F et g, c-myc C, ph phage) et en rouge (C, DHFR ,-globine UNE et E, c-myc B, F, et g, phage). Pour la métaphase (UNE et B), l'ADN a été contre-coloré avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole en bleu. Le chevauchement des signaux rouge, vert et bleu apparaît en blanc. La structure amplifiée était toujours composée d'un mélange de séquences transfectées. Les lignes colorées le long de la fibre indiquent la continuation d'une séquence de plasmide ou de phage. Les flèches dans g et H indiquent les motifs répétés trouvés dans la cotransfection avec l'ADN du phage . Barres, 10 m pour A–C, 20 m pour D–G.

La structure coamplifiée a été analysée par fibre de chromatine FISH. Des images représentatives sont montrées dans la Fig. 3, C–H . La séquence dans la région amplifiée était toujours liée à la séquence plasmidique, cependant, elle formait généralement un long tronçon ininterrompu le long des fibres, avec une taille correspondant à entre une et >10 molécules d'ADN (Fig. 3C) ⇓ . Cela reflète très probablement la ligature entre le site COS conduisant à la formation d'une molécule concatémère. La cotransfection de deux types de plasmides avec différents IR a également entraîné une structure entremêlée, démontrant que la recombinaison non homologue s'est produite fréquemment, comme cela a été suggéré précédemment (30). Cependant, nous avons fréquemment détecté des structures dans lesquelles l'une ou l'autre séquence plasmidique continuait le long de la fibre, dont la longueur correspondait à quelques dizaines de copies de plasmides (Fig. 3, C–E) ⇓ . Ce phénomène pourrait être expliqué par une recombinaison homologue intermoléculaire. Cependant, pSFVdhfr (11 kpb) et p6XNβ (14 kpb) partagent une séquence commune de 6,3 kpb, et 2 kpb sont partagés entre les deux plasmides ci-dessus et pNeo.myc-2,4 (9 kpb). Par conséquent, il est peu probable qu'une longue continuation ininterrompue de l'une ou l'autre séquence plasmidique reflète une recombinaison homologue. De plus, cette activité est connue pour être faible dans les cellules de mammifères, contrairement aux eucaryotes inférieurs. Au contraire, l'analyse de certaines fibres a indiqué que les séquences du plasmide et du phage étaient arrangées comme une répétition en tandem directe (Fig. 3, F et g) ⇓ . Ceci suggère que l'ADN a été ligaturé à l'IR de mammifère par recombinaison avec un plasmide portant l'IR au stade initial de la transfection. La recombinaison intermoléculaire n'a pas pu expliquer de manière satisfaisante de telles répétitions en tandem étant donné qu'un grand nombre de molécules avec des structures différentes ont été transfectées. Cela pourrait suggérer que la réplication autonome de la séquence recombinée se produit avec la multimérisation par le processus intramoléculaire associé à sa réplication. Il est également possible que la continuation de l'une ou l'autre séquence plasmidique le long de la fibre, décrite ci-dessus, puisse résulter d'une multimérisation par un processus induit par la réplication. Auparavant, la dimérisation de l'ADN génomique circulaire a été observée dans des cellules bactériennes contenant une mutation de terminaison de la réplication (31, 32) .

Le HSR est généré par le cycle BFB initié lors de la répétition plasmidique.

En examinant des cellules portant des HSR dérivées de plasmides par FISH, nous avons fréquemment observé des ponts composés de séquences plasmidiques entre deux cellules filles mitotiques ou postmitotiques. De tels ponts ont été observés parmi la propagation chromosomique conventionnelle (Fig. 4) ⇓ . Comme les cellules COLO 320DM n'adhèrent pas au substrat, nous avons utilisé des cellules HeLa humaines pour résoudre ce problème. pSFVdhfr a également généré une HSR dans ces cellules. Ces transformants ont été cultivés sur des lames de chambre, fixées in situ par PFA, et analysée par FISH avec la sonde plasmidique. Le pont composé de séquences plasmidiques a été détecté à l'anaphase (Fig. 4UNE) et télophase/cytokinèse (Fig. 4B) ⇓ mais au début de G1 phase a été démonté (Fig. 4C) ⇓ . Dans certains G1-phase des cellules, une partie de la chromatine brisée est restée dans le cytoplasme, générant ainsi un micronoyau. Au contraire, parmi l'étalement en métaphase, la plupart des séquences plasmidiques HSR ont été détectées à l'extrémité du bras chromosomique (pour des exemples, voir la figure 1 ⇓ ). Sur la base de ces deux observations, nous avons conclu que le cycle BFB est impliqué dans la génération et l'expansion de la HSR dérivée du plasmide. Pour que le cycle BFB démarre au niveau de la séquence plasmidique, une rupture fréquente des brins au niveau de la répétition du plasmide devrait être nécessaire.

Génération de HSR par le cycle BFB. Les cellules portant HSR forment fréquemment un pont anaphase composé de séquences plasmidiques. A–C, les cellules HeLa transformées avec pSFVdhfr ont été cultivées sur des lames de chambre et fixées in situ par PFA. La séquence plasmidique a été détectée par hybridation avec une sonde marquée DIG, suivie d'une détection par fluorescence verte. L'ADN a été contre-coloré avec PI en rouge. A–C représentent les cellules à l'anaphase, la télophase/cytokinèse et le début G1, respectivement. , les cellules du clone 22 portant HSR, qui ont été obtenues par transfection de pSFVdhfr dans COLO 320DM, ont été fixées selon le protocole classique de préparation d'étalement en métaphase. Plusieurs ponts composés de séquences plasmidiques ont été observés entre les cellules. Barres, 10 um.

Un conflit contrôlable entre la réplication et la transcription génère un HSR.

Nous avons construit 10 types de plasmides à partir de pSFVdhfr, qui sont illustrés schématiquement sur la figure 5'. pSFVdhfr possède deux gènes marqueurs de sélection de médicaments, c'est à dire., Bsr et Hyg. Ces plasmides ont été transfectés dans des cellules COLO 320DM, et les cellules ont été sélectionnées avec de la blasticidine. Les emplacements des plasmides dans les transformants regroupés ont été analysés par le FISH comme décrit sur la figure 1'. Au moins trois transfections et analyses indépendantes de ces plasmides ont été réalisées. La fraction de métaphases présentant des signaux aux DMs avait tendance à fluctuer entre différentes transfections, mais la fraction présentant des signaux à HSR était très reproductible. Un exemple représentatif est montré sur la figure 6'. Dans cette expérience, nous avons effectué l'analyse 2, 3 et 4 semaines après la transfection.

Construction des plasmides utilisés sur la figure 6'. Dix dérivés différents de plasmides pSFVdhfr ont été construits. pSFVdhfr possède deux marqueurs de sélection, c'est à dire., Hyg et Bsr. Dans toutes les expériences ultérieures, seule la résistance à la blasticidine a été utilisée pour la sélection des transformants. Le sens de la transcription est indiqué par des flèches noires. Séquence poly(A) HSV située en aval de Hyg a été utilisé pour la construction de pΔBN.poly(A) ou pΔB.poly(A). L'emplacement de Ou Jeβ apparu dans la littérature (26) a été noté comme doubles flèches blanches. Une activité MAR a été détectée dans le DHFR insérer à la position indiquée sur la figure (17) . Pour le MAR exogène, la séquence AR1 de IgL'intron a été utilisé pour la construction de pΔBN.AR1 et pΔB.AR1. RFB de la répétition d'ADNr humain a été inséré dans les deux orientations pour construire pΔB.RFB Dir ou pΔB.RFB Rev. La manière dont le RFB spécifique à l'orientation bloque la fourche de réplication est indiquée par le flèches blanches. Pour la simplicité, la portion vecteur pour la croissance des cellules bactériennes (Ampli et Col E1) a été tiré uniquement dans pSFVdhfr.

Génération des structures amplifiées par transfection de diverses constructions plasmidiques. Les plasmides construits sur la figure 5' ont été transfectés dans des cellules COLO 320DM et les transformants ont été sélectionnés avec de la blasticidine. Deux, 3 ou 4 semaines après la transfection, un étalement chromosomique en métaphase a été préparé à partir d'une partie de la culture et hybridé avec la sonde plasmidique marquée DIG, comme sur la figure 1⇓. Les fréquences de métaphase montrant des signaux hybridés aux DM ou à la HSR ont été calculées à partir de >30 métaphases examinées et sont représentées graphiquement. N.D., non déterminé.

Lorsque pSFVdhfr a été transfecté, 20 à 40% des cellules transformées avaient une HSR composée de séquences plasmidiques (Fig. 6UNE) ⇓ , cependant, pSFV-V n'a pas produit de HSR (Fig. 6B) ⇓ . Cela indiquait que DHFR L'IR est nécessaire pour la génération de HSR et a suggéré que la réplication à partir de l'IR pourrait induire une rupture de brin. Au contraire le Bsr l'unité de transcription n'avait pas de séquence d'addition poly(A) en aval. Étant donné que l'addition de poly(A) est couplée à la terminaison de la transcription (pour une revue récente, voir Réf. 33), une collision frontale entre la transcription et la réplication peut être anticipée si la réplication est initiée à partir du DHFR RI. Il est important de noter que les séquences plasmidiques amplifiées sont arrangées comme une répétition directe dans laquelle l'orientation mutuelle entre chaque séquence est la même que celle de la construction circulaire d'origine. Par conséquent, nous avons placé des séquences poly(A) en aval de Bsr (pΔBN.polyA et pΔB.polyA). La transfection de ces plasmides a à peine produit des HSR, alors que les plasmides parents (pΔBN et pΔB) ont produit de nombreux HSR (comparer la figure 6, F et je, à, et g , respectivement). Cela indiquait que s'il était placé au point où la transcription et la réplication devaient se rencontrer, le signal poly(A) supprimait presque complètement la génération de HSR. pΔB a produit une fréquence de HSR relativement plus faible que pSFVdhfr ou pΔBN. La séquence de 202 pb à la fin de HSV poly(A), qui a été supprimée lors de la construction de pΔB, pourrait avoir un effet sur la transcription de Hyg, même si Hyg n'a pas été utilisé pour la sélection. En outre, un effet frappant a été obtenu en utilisant RFB dérivé d'un humain ADNr répéter. RFB arrête la progression de la fourche de réplication de l'ADN d'une manière dépendante de l'orientation, et son action rend la transcription de l'ADNr possible, même pendant sa réplication (27). Dans nos expériences, RFB a inhibé la génération de HSR d'une manière dépendante de l'orientation (Fig. 6, J et K) ⇓ . Plus précisément, s'il a été placé dans une orientation qui bloque la réplication du DHFR IR (pΔB.RFB Dir.), les cellules ayant des HSR n'apparaissaient pas, alors qu'elles apparaissaient fréquemment si le RFB était placé dans une orientation inverse (pΔB.RFB Rev.). Dans ce dernier cas, la réplication rencontre directement la transcription de Bsr. Pris ensemble, ces résultats suggèrent fortement que si la réplication de la DHFR IR a rencontré la transcription de Bsr, une rupture de brin d'ADN a été induite. Ce conflit a été résolu en insérant le signal d'addition poly(A) ou le RFB dans une orientation qui bloquait la réplication à partir de l'IR.

Nous avons ensuite abordé l'effet des séquences MAR. pΔBN.AR1 et pΔB.AR1 ont une séquence montrant une forte activité MAR (AR1) en aval de Bsr. En transfectant ces plasmides, nous avons constaté que le fait de placer MAR à cette position augmentait la génération de HSR (comparer Fig. 6, E et HD et g ). A partir de ce résultat, nous avons émis l'hypothèse que la présence de MAR entre la réplication et la transcription peut conduire à une rupture de brin. Au contraire, la transfection de pINV.PasJ'ai abouti à une très faible fréquence de formation de HSR. Parce que pINV.PasJe différais du pSFVdhfr original en ce qui concerne l'orientation du DHFR insérer, l'ordre de Ou Jeβ et le MAR intrinsèque a été inversé par rapport à Bsr transcription. Bien que le MAR intrinsèque ait été relativement éloigné de Bsr dans la construction d'origine, il peut contribuer à la rupture des brins. Inversion de la DHFR l'insert a entraîné l'absence de MAR entre la réplication et la transcription, ce qui pourrait expliquer le très petit nombre de HSR générés par pINV.PasI. De plus, les résultats rapportés dans notre étude précédente (17) appuient cette hypothèse. À savoir, la suppression du signal de traitement 3′ du SV40, qui fonctionne comme un MAR en plus du signal d'addition poly(A) du gène de résistance à la néomycine en aval, a conduit à la suppression complète de la formation de HSR. Dans cette construction, la transcription du gène de résistance à la néomycine a rencontré directement la réplication du c-myc IR en l'absence de MAR. L'insertion d'une autre séquence MAR (AR1) à la place de la séquence SV40 a conduit à une formation HSR de haut niveau. Ainsi, toutes les données disponibles sont cohérentes avec l'hypothèse que la présence de MAR entre la réplication et la transcription conduit à une rupture de brin.


Techniques de détection de séquences télomériques

Comme indiqué précédemment, plusieurs techniques peuvent être appliquées aux préparations chromosomiques afin de détecter les séquences télomériques présentes au niveau des chromosomes. Ces techniques ayant été décrites ailleurs (1, 39), elles seront brièvement évoquées ici. Le FISH conventionnel utilisant une sonde oligonucléotidique synthétique (TTAGGG ou CCCTAA)n a été utilisé avec succès pour in situ détection de séquences télomériques dans les chromosomes de diverses espèces de vertébrés [voir, par ex. (32)]. Cependant, l'efficacité des sondes d'ADN télomériques n'a pas été suffisante pour étendre la FISH conventionnelle au-delà de l'analyse qualitative des séquences télomériques ou même pour détecter tous les télomères humains puisque moins de 85 % des télomères ont pu être identifiés dans les lymphocytes humains (50, 51).

La technique PRINS, basée sur la in situ annelage d'oligonucléotides synthétiques (CCCTAA)7 à des séquences d'acides nucléiques complémentaires suivies d'une extension d'amorce en présence d'un nucléotide marqué par un haptène ou un fluorochrome (52, 53), offre une méthode plus rapide que la FISH conventionnelle pour la in situ le marquage des séquences télomériques et offre une efficacité supérieure au FISH conventionnel pour la détection des séquences télomériques et des ITS (54-56).

Le PNA-FISH pour la détection de séquences télomériques est basé sur l'utilisation d'une sonde télomérique PNA. Les PNA sont des imitateurs d'ADN synthétiques dans lesquels le squelette sucre phosphate a été remplacé par un squelette polyamide non chargé et flexible, et par conséquent, ils sont très résistants à la dégradation par les DNases, RNases, protéinases et peptidases (57). En raison du squelette neutre, les sondes PNA pénètrent dans le chromosome, et ainsi, une sonde PNA télomérique fournit une efficacité plus élevée et bien meilleure dans la détection des séquences télomériques que le FISH conventionnel. La technique télomérique PNA-FISH a été largement utilisée pour détecter les répétitions télomériques dans les cellules humaines et autres vertébrés, donnant une efficacité de détection de 100 % des télomères humains (58–61). En outre, PNA-FISH peut être utilisé pour évaluer la longueur des répétitions télomériques sur des chromosomes individuels ou la taille des ITS, c'est-à-dire une analyse quantitative des télomères à l'aide de la technique quantitative (Q)-FISH (17, 18, 62, 63). [Pour une discussion des avantages et des inconvénients du PNA-FISH par rapport au PRINS pour la détection des télomères, voir (1, 39).]

En revanche, pour l'identification de certaines aberrations spécifiques impliquant des séquences télomériques, la technique d'orientation chromosomique (CO)-FISH doit être appliquée. CO-FISH est une technique d'hybridation spécifique à un brin couramment utilisée pour déduire l'orientation des séquences le long des chromosomes (64). En particulier, la technique télomérique CO-FISH est utilisée pour discriminer entre les différents types de fusions télomériques et pour détecter les échanges de chromatides sœurs télomériques (T-SCE) (13, 65). Dans cette procédure, les cellules sont cultivées en présence de 5-bromodésoxyuridine (BrdU) et/ou de bromodésoxycytidine (BrdC) pour un seul cycle de réplication afin que les chromatides sœurs soient substituées de manière uniforme. Après culture, les préparations chromosomiques sont exposées à la lumière UV et à un traitement à l'exonucléase III (Exo III). Exposure of chromosomes to UV light in the presence of the photosensitising DNA dye Hoechst results in numerous strand breaks occurring preferentially at the sites of BrdU/BrdC incorporation, which serve as selective substrates for enzymatic digestion by Exo III. This results in the specific removal of the newly replicated strands, leaving the original (parental) strands largely intact. Thus, after CO-FISH, chromatids are single stranded and, when using a single-stranded DNA or PNA probe, only one chromatid will show a hybridisation signal if the tandem repeats are oriented head to tail along the DNA strand ( 13, 65). Accordingly, while standard FISH or PRINS with a telomeric probe produces four signals per chromosome, two at each end, CO-FISH typically yields just two signals, one at each end of the chromosome.


Future Perspectives and Conclusion

Most of the clinically relevant examples described in this review use targeted LRS approaches, indicating that the broader use of LRS could significantly increase the diagnostic yield of genetic testing and discover novel disease genes. Especially SVs, repetitive elements and complex genomic regions that are difficult to assess with short reads can now be better assessed. LRS technology is also changing our view on the mRNA isoform landscape of different tissues and genes, potentially enabling better functional interpretation of genomic variation in the future. It is noted that, while the currently used LRS technologies are not quite yet at the stage of individual fully phased de novo assembled genomes, but with increased throughput, higher accuracy and lower costs, LRS-based WGS is coming within reach. Once this is routine, we are foreseeing the possibility that WGS with long reads could serve as a truly generic test that enables to detect all genetic variants present in an individual’s genome. Then the power of LRS to overcome the current limitations in medical genetics may be elucidated at fast pace. Moreover, systematic studies utilizing LRS in patient cohorts with unsolved genetic diseases and control populations are warranted, and several consortia, e.g., www.solve-rd.eu or http://www.internationalgenome.org/1000-genomes-browsers, have already announced the use of LRS-WGS for this.

While the medical genetics community is now starting to realize the potential of this technology, some obstacles need to be overcome in order for LRS to be established as a mainstream tool (for overview of LRS limitations, see Box 1). Especially library preparation and analysis still need to reach the high level of robustness of SR-NGS technologies. For the data analysis, bioinformatic tools have traditionally been optimized for short-read sequencing data and need to be adapted, as well as thoroughly tested, for long reads (Sedlazeck et al., 2018a). In addition, analyzing whole genomes with LRS is still very expensive and the future application will depend largely on pricing progress of all NGS technologies, and may also depend on how fast the short-reads can reach an even lower prices with even better quality (i.e., the �$ genome). Eventually, one might need to consider a choice between sequencing many less-expensive genomes with short-reads as opposed to investigating a smaller number of genomes in-detail using long reads. It is not a straightforward decision to make, however, the latter option would ideally be beneficial for an individual patient in clinical diagnostics. Combining SR-NGS and LRS can also be a powerful approach for highly accurate variant calling and assembly (Chaisson et al., 2019) and become increasingly important and more easily available with the planned acquisition of PacBio by Illumina.

We foresee that both of the prevailing LRS technologies, PacBio and ONT, will have a major influence on the future of medical genetics. ONT has the potential to become low in price, ease of use technology that is capable of directly investigating both native DNA and RNA in a high-throughput manner. The main challenge for ONT technology is to circumvent the systematic error rate, e.g., for homopolymer regions, which may be a limitation especially for future diagnostic applications. ONT has put forward ideas to improve this by optimizing bioinformatic tools that allow more accurate repeat lengths measurements and proposed to leverage different types of nanopores. One possible improvement was already enabled by the rolling circle amplification to concatemeric consensus method (R2C2) (Volden et al., 2018). For SMRT sequencing, the consensus accuracy achieved is better, especially once intra-molecule consensus – in addition to the existing inter-molecule consensus – calling is also feasible for long-insert libraries. To enable human genome sequencing, throughput needs to go up. To this end, PacBio has recently announced to release a SMRT cell with 8 million ZMWs in 2019 (𢏈-fold increase) and other improvements may come from even longer read lengths. This would enable much higher throughput and reduction in sequencing costs. Altogether, it remains to be seen whether the quality of the LRS technologies is sufficient for genome-wide detection of small indels and SNVs. If so, PacBio and ONT will have a chance to become the platform for true WGS for population scale studies in the near future. Moreover, the native epigenetic modifications of the DNA are preserved in PCR-free single molecule sequencing, opening up possibilities for novel LRS-based applications to assess base modifications (Pham et al., 2016 Euskirchen et al., 2017).

In addition to already commercially available technologies discussed in this review, others are in active development and will hopefully be available for users in the future. These include novel nanopore-based technologies from Genia (now acquired by Roche) and Stratos Genomics (Carson and Wanunu, 2015 Fuller et al., 2016), or the Electronic Nano-Device sequencing (ENDSeq) from Roswell Biotechnologies (Pugliese et al., 2015). Other exciting technologies that may also provide long-read insights are, e.g., library-and amplification-free technology from Nanostring (Hyb & Seq), nanochannel genome mapping technology from Bionano Genomics (Lam et al., 2012 Seo et al., 2016) and Strand-Seq that preserves long-range context of homologous chromosomes (Sanders et al., 2017 Ghareghani et al., 2018). Whether these or other technologies are complementary to the existing LRS approaches, or may be able to compete with or even replace PacBio and ONT remains to be seen.

To conclude, we are on the advent of next revolution in sequencing technology. Once the major obstacles regarding accuracy, analysis and pricing are overcome, the time would be right to move towards individual fully phased long-read genomes, likely based on individual de novo assemblies that enable the identification of all the genetic variants regardless of their type.


The Nobel disease meets DNA teleportation and homeopathy

Eh bien, pas exactement. I think I'm just suffering a case of what I like to call "anti-vax burnout." It's been a busy couple of weeks on the antivaccine front, given the new set of revelations about Andrew Wakefield, including even more detail about the nature of the scientific fraud he committed and previously untold information regarding just how extensive his business plans were to profit from the MMR scare that his fraudulent science was instrumental in launching in the U.K. Regular readers know that, from time to time, when the news about the anti-vaccine movement is coming fast and furious and I feel obligated to blog about it, I sometimes start to feel this way. When that happens, to avoid burnout, I need to step back for a day or two (or three or four) and blog about something else for a while. In this case, I need to do even more than that. I need something light and fluffy, amusing and silly. And what could be sillier than homeopathy?

Actually, I think I might have the answer. I just saw an article entitled Foundations Of Science Shaken: DNA Can Teleport Says Professor Jeff Reimers. Teleporting DNA! Impressionnant! Now there's just the remedy I need for my Wakefield fatigue! After all, when I see woo this entertaining, I can't help but smile, no matter how much my blood pressure might have risen in outrage at the latest revelations about Wakefield. Get a load of this:

Professor Jeff Reimers, of the University Of Sydney in Australia, has concluded from experiments that DNA can mysteriously be teleported.

From the work Reimers has completed, Nobel Prize winner, Dr Luc Montagnier believes that there is evidence that DNA can transport electromagnetic imprints of itself to cells within the body which it has absolutely no contact with, according to the New Scientist which released the results yesterday.

How the process occurs is now up for debate as Professor Reimers projects that enzymes are tricked into believing that the electromagnetic imprints projected by DNA and mistaken as real.

Holy Star Trek, Spock! Where's Scotty when you need him?

First of all, it's hard not to note that Luc Montagnier is back again. As I pointed out recently, after having been awarded the Nobel Prize, Montagnier has gone woo. But not just woo, the most hilariously bogus woo of all, a woo that, for it to be true, would require that much of what we know about physics, chemistry, and biology be not just wrong, but spectacularly wrong. Yes, indeed, we're talking about homeopathy, although I only learned about the homeopathy angle in the context of discussing how Montagnier has decided to study dubious therapies for autistic children. Clearly, Montagnier has come down with the Nobel disease, as evidenced by his pursuit of autism quackery, his reporting that DNA can generate radio waves, and, above all, his embrace of homeopathy.

But what about Jeff Reimers? I had never heard of him before so before I look at his claims I invoked almighty Google, and Professor Reimers does appear to be a real chemist. In fact, he is even listed as having won awards, such as the Royal Australian Chemical Institute Award and being inducted into the Australian Academy of Science. His University of Sydney webpage lists his research interests as:

  • Solvent efffects on molecular properties
  • Interpretation of infrared and electronic spectra
  • Electroabsorption spectroscopy
  • Structure and function of photosynthetic reaction centres
  • Design and operational principles of molecular electronic devices

When I see a story like this, I often wonder whether the scientist's work is being represented accurately. A bit of clicking and searching rapidly brought me to this New Scientist article entitled Scorn over claim of teleported DNA. One thing that became clear is that Professor Reimers is not the person who did the experiments (they came out of Luc Montagnier's laboratory), although he was quoted as saying that these experiments "would be the most significant experiments performed in the past 90 years, demanding re-evaluation of the whole conceptual framework of modern chemistry."

Let's take a look at what Montagnier appears to have done:

Luc Montagnier, who shared the Nobel prize for medicine in 2008 for his part in establishing that HIV causes AIDS, says he has evidence that DNA can send spooky electromagnetic imprints of itself into distant cells and fluids. If that wasn't heretical enough, he also suggests that enzymes can mistake the ghostly imprints for real DNA, and faithfully copy them to produce the real thing. In effect this would amount to a kind of quantum teleportation of the DNA.

Hoo boy. Not surprisingly, these experiments have not been published in the peer-reviewed literature so it's impossible yet to determine what, exactly, Montagnier did and what he is claiming. In other words, we have publication by press release, a huge red flag for quackery or pseudoscience. A Nobel Laureate like Montagnier really should know better. Unfortunately, whatever led him to go woo apparently also led him to abandon standard scientific protocol for reporting experimental results to fellow scientists. Once you go woo, I guess, you don't come back.

But I still don't know exactly what Montagnier did and what he believes he has found. So let's look a bit farther:

Full details of the experiments are not yet available, but the basic set-up is as follows. Two adjacent but physically separate test tubes were placed within a copper coil and subjected to a very weak extremely low frequency electromagnetic field of 7 hertz. The apparatus was isolated from Earth's natural magnetic field to stop it interfering with the experiment. One tube contained a fragment of DNA around 100 bases long the second tube contained pure water.

After 16 to 18 hours, both samples were independently subjected to the polymerase chain reaction (PCR), a method routinely used to amplify traces of DNA by using enzymes to make many copies of the original material. The gene fragment was apparently recovered from both tubes, even though one should have contained just water (see diagram).

DNA was only recovered if the original solution of DNA - whose concentration has not been revealed - had been subjected to several dilution cycles before being placed in the magnetic field. In each cycle it was diluted 10-fold, and "ghost" DNA was only recovered after between seven and 12 dilutions of the original. It was not found at the ultra-high dilutions used in homeopathy.

OK, now things are starting to come into focus. I do PCR. Before I found myself rising to more administrative positions and laboratory supervisory roles and even well into the time after I became a PI, I've personally run thousands of PCR assays. I've done PCR since my graduate school days in the early 1990s, back when PCR machines took up half a benchtop and there was only one PCR machine in the entire department where I earned my PhD. I know PCR. Whenever doing a PCR experiment like this, it's very, very important to rule out contamination, because it's incredibly easy to amplify contaminating bits of DNA. For example, it's very easy to amplify human DNA sequences if those sequences are found in the skin because skin flakes are virtually everywhere humans are and are amazingly good at finding their way onto the surfaces of Eppendorf tubes where PCR reactions are run. PCR can be incredibly sensitive, which is why it doesn't take much contaminating DNA at all to produce false positive amplifications of a sequence of interest, particularly when doing PCR with a lot of cycles or sequential PCR. That's because PCR does not discriminate between contaminating DNA and the DNA of interest. There is even a phenomenon known as primer dimer, in which somehow the two primers used to start the reaction can hook up at their ends and form a template to allow PCR amplification to proceed. This usually produces short sequences whose size is equal to approximately twice the length of the primers. Many are the PCR experiments that have been ruined by contamination--including my own. That's why negative controls are absolutely essential.

I saw no description of adequate negative controls.

As much as I hate to do it given my Wakefield fatigue, let's bring it on home to the example of Andrew Wakefield. You might recall that in followup experiments he claimed to find measles sequences in the gut of autistic children. As you might recall, PCR expert Stephen Bustin eviscerated Andrew Wakefield's work during his testimony in the Autism Omnibus proceeding by pointing out that the the lab used to measure measles sequences was also used to grow up and isolate the plasmids containing measles sequences used as positive controls was the same laboratory where the PCR was run. If Montagnier did the same thing, there was the potential for major contamination that PCR could easily pick up. Even if he didn't, the potential for contamination was still there, and it doesn't take much.

Sometimes, tracing the source of contamination can be incredibly difficult. Indeed, I remember a several month period in which I kept getting a positive signal for my gene by PCR in the distilled, deionized water. I did everything. I scrubbed down the desks and work benches. I replaced all the water in the lab. I scrubbed down all the scales and cleaned out all the pipetman. We basically went crazy in the lab looking for potential sources of contamination causing the false positive signal. We even started changing PCR primers. Nothing worked. Then, just as suddenly and mysteriously as it appeared, the false positive band disappeared. Strange are the ways of PCR. Particularly intriguing with respect to possible contamination as a cause of Montagnier's reported results is the fact that he reports that he had to carry out multiple dilutions to achieve the results. The more handling of the water, the more dilutions, the more potential for contamination. At least, that's how it appears to me.

So was Montagnier snookered by contamination? Je ne sais pas. He might or might not have done adequate controls, but there's no way of knowing from which is true from the descriptions of the experiments in this article. I also wonder if he tried multiple different DNA sequences. If his result is robust, one would expect that it wouldn't depend on the use of any specific 100 bp DNA sequence--or that it would require a 100 bp sequence. It should be observable with many sequences. I'd also want to know why Montagnier chose 100 bp as the length of DNA sequence he amplified. Why not 200 bp? Or 1000 bp? Above all, I'd be absolutely insistent on a number of appropriate negative and positive controls and a double blind design for handling the samples and running the PCR. (I'd bet money that this latter control wasn't done.) Only then would I start to wonder if something real is going on. Even then I would want to see replication by other laboratories before I would start to believe it. No scientific result that has only been shown in one laboratory should be taken as anywhere close to definitive, and I don't care whose laboratory demonstrated it.

Even if Montagnier's results were replicated, I'd still be very skeptical of Montagnier's explanation for his results:

Physicists in Montagnier's team suggest that DNA emits low-frequency electromagnetic waves which imprint the structure of the molecule onto the water. This structure, they claim, is preserved and amplified through quantum coherence effects, and because it mimics the shape of the original DNA, the enzymes in the PCR process mistake it for DNA itself, and somehow use it as a template to make DNA matching that which "sent" the signal

And Montagnier wonders why people think he's caught the "Nobel disease." We already know that water does not have "memory," as homeopaths claim. Eh bien, pas exactement. It's that whatever "memory" water has lasts on the order of picoseconds. There's no known way that water can "remember" the structure of a large molecule long enough that an enzyme could not only recognize it but duplicate and amplify it. Once again, given how well established the science is that says that homeopathy can't work and that water doesn't have memory that lasts anywhere long enough to do what homeopaths claim, in order for Montagnier to convince scientists that his results are correct and that they indicated the "memory" of water, he's going to have to come up with evidence on the order, in terms of quantity and quality, of the evidence supporting the science that concludes that his experiment can't work.

I also find it rather amusing how homeopaths and those who have fallen under the spell of homeopathy always manage to find more "explanations" for how homeopathy allegedly "works." Be it John Benneth's "nanocrystalloids," Bienveniste's "memory of water," or (now) Luc Montagnier's "teleporting" DNA (and presumably other molecules), homeopaths are prolific when it comes to thinking up post hoc explanations for the most ridiculous pseudoscience there is. It goes precisely in the wrong direction, too. Before coming up with a mechanism to explain a scientific phenomenon, in general, it's a good idea to demonstrate that the phenomenon is actually real and reproducible. Homeopathy fails on all these counts. De nouveau.

There, now. That was a nice break from all that depressing contemplation of Andrew Wakefield.


DISCUSSION

In this study, we have demonstrated that disruption of C. elegans Ku does not affect telomere length or cause spontaneous telomere uncapping and end-to-end chromosome fusion, phenotypes that have been observed in other systems, but are either controversial within a species or not conserved (Figure 1 and data not shown). Furthermore, in a telomerase-deficient background, disruption of Ku did not increase the rate of telomere shortening or cause a synthetic lethal or accelerated senescence phenotype (Figure 1). The severe effects of Ku deficiency in yeast or plant telomerase mutants contrast sharply with the lack of such effects in C. elegans or mice, suggesting that the role of Ku at telomeres in multicellular animals has been significantly altered, possibly in the context of functional redundancy (B oulton and J ackson 1996a,b B aumann and C ech 2000 R iha et al. 2002 C arter et al. 2007).

Here, we have established that C. elegans telomere replication mutants can accumulate end-to-end fusions in the absence of DNA ligase IV. Our findings are in strong agreement with studies that show DNA ligase IV is not required for end-to-end fusion of critically shortened telomeres in telomerase mutants in Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Arabidopsis thaliana, or mice (B aumann and C ech 2000 H ackett et al. 2001 H eacock et al. 2004 M aser et al. 2007). In contrast, end-to-end fusion of uncapped telomeres of normal length in S. cerevisiae, S. pombe, Kluyveromyces lactis, and mice depends on DNA ligase IV (F erreira and C ooper 2001 S mogorzewska et al. 2002 M ieczkowski et al. 2003 P ardo and M arcand 2005 C arter et al. 2007). Thus, processing and fusion of acutely uncapped long telomeres can rely on a specific DNA repair pathway (canonical NHEJ), whereas fusion of telomeres that shorten progressively in the absence of telomerase may be a more promiscuous process that can occur via several DNA repair pathways (R iha et al. 2006).

Molecular analyses of dysfunctional telomeres in yeast, plants, worms, mice, and humans have revealed that end-to-end fusion can be mediated by direct ligation of uncapped telomeres (H ackett et al. 2001 H emann et al. 2001 M ieczkowski et al. 2003 H eacock et al. 2004 C heung et al. 2006 C apper et al. 2007). However, the frequency of directly ligated fusion breakpoints could not be determined in these studies, which would miss (1) direct fusion events that involve extensive terminal deletion or (2) complex fusion breakpoints with insertions of large segments of DNA. The holocentric chromosomes of C. elegans result in stable end-to-end fusions where an unbiased collection of initial fusion events can be outcrossed and recovered for quantitative analysis in a manner that is not possible in most model systems. We found that direct fusion events at critically shortened telomeres occur infrequently (Figure 2A and Table 3). In a parallel approach resembling PCR-based experiments conducted in other systems, PCR primers at 11 of 12 chromosome ends failed to reveal significant levels of direct end-to-end fusions in genomic DNA from 28 strains harboring end-to-end fusions. Thus, independent approaches indicate that direct ligation does not explain the majority of DNA repair events at critically shortened telomeres.

Although other molecular studies have not measured the frequency of direct fusions, some were able to detect a greater absolute number of direct fusions than we have observed. One possible explanation for this discrepancy is that some studies in monocentric organisms have relied on Southern analysis to detect fusion PCR products (H eacock et al. 2004 C apper et al. 2007) or have cloned and sequenced the products of entire PCR reactions (H eacock et al. 2004 C heung et al. 2006) to recover direct fusions that may not have been apparent on gels stained with ethidium bromide (Figure 4A). In addition, direct fusion events may be more frequent in specific cell types (e.g., somatic cells) or organisms, and we might have missed cell-type specific fusions using our PCR-based approach, which was designed to detect stable fusions that were transmitted via germ cells prior to preparation of genomic template DNA for PCR. In this context, HR is the primary DSB repair pathway in C. elegans germ cells, whereas NHEJ is a major DSB repair pathway in noncycling somatic cells (C lejan et al. 2006). Nevertheless, we were able to recover some NHEJ-mediated direct fusion breakpoints, consistent with independent reports that NHEJ-mediated DSB repair can occur in C. elegans germ cells (M orton et al. 2006 R obert and B essereau 2007). We speculate that developmental regulation of DNA repair pathways may modulate end-to-end fusion during tumorigenesis in mammals.

How do the majority of end-to-end chromosome fusions arise? Southern analysis of genetically isolated end-to-end fusions revealed that probes flanking fusion breakpoints that were refractory to PCR detected restriction fragments of different sizes, whereas a single fusion breakpoint restriction fragment would have been detected for a direct ligation event (Figure 5). Thus, many initial fusion breakpoints that arise when telomerase is deficient may contain insertions of large segments of genomic DNA. In human cells, end-to-end chromosome fusion results in dicentric chromosomes that often break during anaphase and subsequently form new fusions, which impedes analysis of their fusion breakpoints (B ailey and M urnane 2006). Either these initial fusion events or the ensuing genomic instability associated with breakage–fusion–bridge cycles (M c C lintock 1941) may promote tumorigenesis (M urnane and S abatier 2004). Our results suggest that a significant fraction of end-to-end chromosome fusion breakpoints that arise when telomerase is deficient may represent complex recombination events.

Studies in other systems are consistent with our observations. Molecular and genetic analyses of telomerase-deficient yeast mutants have revealed that dysfunctional telomeres can copy large segments of DNA from an intact chromosome end via break-induced replication (H ackett et al. 2001). End-to-end fusion and recombination between sister chromatids occurs at dysfunctional telomeres in mammalian cells and can generate duplications at chromosome ends, as shown in cytological studies (B ailey and M urnane 2006). Furthermore, a complex fusion breakpoint involving a small duplication of one chromosome end was recovered by PCR in the context of telomerase deficiency in A. thaliana, an observation that agrees with cytogenetic measurements that revealed fusion of homologous chromosomes or sister chromatids (S iroky et al. 2003 H eacock et al. 2004). Sister chromatid recombination events have also been observed in C. elegans using template genomic DNA from trt-1 mutants and a PCR primer that targets a single chromosome end (C heung et al. 2006). Together, the latter observations suggest that alternatives to direct end-to-end fusion exist. Thus, the low frequency of direct fusion events observed for end-to-end chromosome fusions genetically isolated from C. elegans, as well as in genomic DNA from late-generation telomerase mutants, may be broadly relevant.

We conclude that the majority of end-to-end fusions that occur as a consequence of telomere erosion may be fundamentally different in nature from the direct fusion events that can be detected by PCR-based analysis of heterogeneous mixtures of genomic DNA harboring end-to-end fusions.


A four-stranded cross-shaped DNA structure (named after British geneticist Robin Holliday) that forms during the process of genetic recombination.

A branch of nanotechnology concerned with the design, study and application of DNA-based synthetic structures to take advantage of the physical and chemical properties of DNA.

DNA structures that as building blocks can be tiled into higher order (usually periodic) structures.

A class of technologies for building DNA nanostructures by folding a long single-stranded DNA (scaffold) into desired shapes via base pairing.

A long single-stranded DNA serving as the major component of a DNA origami structure, which will be folded into a defined shape.

Short single-stranded DNAs that help fold the scaffold DNA via crossover base pairing.

The locations of staple DNAs, including their extensions or modifications, on a DNA origami structure. These points can be prescribed as each staple has a globally unique base sequence (a unique address).

A stacking arrangement of the planes of nucleobases or base pairs in the structure of nucleic acids, leading to a strong π–π interaction vertical to the planes, which is a major force that stabilizes DNA duplex structures.

Groups of enzymes in which the reaction product of one enzyme is the substrate for the next.

The translation of concrete DNA reactions into abstracted algorithms and instructions. By this method, the complex details are hidden from the persons operating the computing systems.

Molecular computation implemented in living organisms, whose inputs/outputs are often interfaced with biological pathways/functions.

A molecular machine made by DNA origami that can autonomously perform specified task(s) with precise motions at the nanoscale.

The molecular binding strength as a result of multiple, non-covalent interactions, for example between an antibody and a complex antigen.

Structural motifs that serve as units for assembly of higher order structures.

(XNAs). Artificially synthesized nucleic acids that do not exist in nature (for example, nucleic acids carrying unnatural backbones, bases or chemical modifications).


Voir la vidéo: Le principe de La PCR et leur différents étapes (Janvier 2022).