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Le nitrate peut-il être un accepteur d'électrons pour le NADH généré dans le cycle de l'acide citrique ?


Le cycle de l'acide citrique est-il aérobie ou anaérobie ? Je sais que l'oxygène est nécessaire pour accepter les électrons NADH afin que le NAD+ puisse être régénéré. Néanmoins, si d'autres accepteurs d'électrons, comme le nitrate (NO3-), sont présents, pourraient-ils également être utilisés pour régénérer le NAD+? Je pose cette question parce que j'ai lu une thèse affirmant que "l'acétly-CoA entre dans le cycle de l'acide citrique et par la respiration anaérobie des nitrates, une quantité multiple d'ATP est générée". Si vous avez de la littérature à partager avec moi, je vous en serais très reconnaissant. Merci.


Oui, de nombreux microbes peuvent utiliser des accepteurs d'électrons autres que l'oxygène.

https://en.wikipedia.org/wiki/Anaerobic_respiration

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165611000289


Les piles à combustible microbiennes comme plate-forme technologique pour le traitement durable des eaux usées

18.5.2 Accepteurs d'électrons

L'accepteur d'électrons contribue à surmonter les pertes potentielles existant sur la cathode, c'est donc l'un des principaux facteurs influençant la production d'énergie dans les MFC. Les conditions pour être un bon accepteur d'électrons comprennent la possession d'un potentiel redox élevé, une cinétique rapide, une valeur économique et de préférence une durabilité et une disponibilité aisée [42] . L'oxygène est l'un des accepteurs d'électrons les plus prometteurs dans les MFC [43] . Cependant, avec les progrès rapides de la technologie MFC ainsi qu'une meilleure compréhension de son principe, il existe une large prise de conscience que le processus cathodique est bien plus qu'une simple réaction de réduction de l'oxygène (ORR). Divers accepteurs d'électrons alternatifs, tels que le nitrate (NO3 − ), les ions métalliques, le perchlorate, le nitrobenzène et les colorants azoïques ont été intensivement explorés pour réaliser la bioremédiation dans les MFC [44] .

Afin d'augmenter la cinétique de réduction de l'oxygène et de réduire le surpotentiel d'activation cathodique, différents types de catalyseurs ont été utilisés dans la cathode [45] . Le platine offre les performances catalytiques les plus élevées avec une affinité pour l'oxygène accrue et une perte d'activation réduite, et est le catalyseur le plus couramment utilisé pour l'ORR [42] . Logan et al. ont démontré que les MFC à base de Pt pouvaient atteindre une puissance de sortie cinq fois supérieure à celle d'un MFC avec une cathode en carbone ordinaire [46] . D'autres catalyseurs moins chers et plus durables, comme le dioxyde de plomb [47] , Fe/Fe2O3 [48] ​​, le cobalt [49] , le dioxyde de manganèse [42] , ou encore le charbon actif [50] ont également été explorés pour des réactions de réduction de l'oxygène à la cathode des MFC. Certaines études ont également montré la possibilité d'utiliser des oxydants métalliques (par exemple, U, Cd, Cr, Cu) qui peuvent être réduits à un état d'oxydation moins toxique. L'ORR reste l'un des principaux goulots d'étranglement de cette technologie, en raison de son surpotentiel élevé et des faibles cinétiques rencontrées [41] .

Les biocathodes représentent une approche innovante pour produire des cathodes durables en utilisant des microbes comme catalyseurs pour faciliter la réduction électrochimique à la surface de la cathode. Les biocathodes éliminent le besoin de catalyseurs chimiques coûteux, réduisent les coûts de construction et d'exploitation, et offrent une flexibilité dans la production de produits de valeur [51] . La biocathode nécessite des conditions physiologiques optimales qui favorisent la croissance microbienne à la surface de la cathode. Contrairement aux bactéries respirant l'anode dans l'anode, les microbes dans la biocathode devraient avoir la capacité de recevoir des électrons de la surface de la cathode (c'est-à-dire électrotrophes). La croissance des biofilms sur la cathode peut être réalisée avec des techniques spéciales telles qu'une inversion électrique des électrodes. Peu d'études scientifiques ont confirmé que la cathode chargée de biofilm peut être conditionnée dans un environnement oxique puis commutée en une anode génératrice de courant. Cela indique que les micro-organismes exoélectrogènes et électrotrophes peuvent être maintenus dans les biofilms d'électrode lorsque la cathode passe des conditions oxiques aux conditions anoxiques. Différentes approches ont été adoptées pour améliorer la cinétique à la surface de la cathode en utilisant des médiateurs tels que le ferricyanure ou des oxydants forts tels que le permanganate, des électrodes catalytiques avec un catalyseur au platine, des bactéries catalysant l'oxydation des métaux de transition, et les bactéries catalysant la réduction de l'oxydant final (c'est-à-dire accepteur d'électrons via des mécanismes de transport d'électrons directs ou indirects, y compris les produits métaboliques).


Résumé

Le nitrate d'anions inorganiques (NO3 − ) et de nitrite (NO2 − ) étaient auparavant considérés comme des produits finaux inertes du métabolisme endogène de l'oxyde nitrique (NO). Cependant, des études récentes montrent que ces anions supposés inertes peuvent être recyclés in vivo pour former du NO, représentant une source alternative importante de NO par rapport à la voie classique de la l-arginine-NO-synthase, en particulier dans les états hypoxiques. Cette revue examine les nouvelles fonctions biologiques importantes de la voie nitrate-nitrite-NO et met en évidence les études qui impliquent le potentiel thérapeutique du nitrate et du nitrite dans des conditions telles que l'infarctus du myocarde, l'accident vasculaire cérébral, l'hypertension systémique et pulmonaire et l'ulcération gastrique.


Conclusion

Dans cette étude, nous avons démontré que la souche DHT3 convertit les œstrogènes en androgènes via une méthylation médiée par la cobalamine et catabolise ensuite les intermédiaires androgènes en HIP via le 2,3-seco sentier. La découverte complète les voies centrales du catabolisme bactérien des stéroïdes (Fig. 1). En bref, les bactéries anaérobies utilisent une voie catabolique convergente (la 2,3-seco voie) pour cataboliser les stérols, les androgènes et les œstrogènes, tandis que les bactéries aérobies adoptent des voies divergentes pour cataboliser 1) les stérols et les androgènes (9,10-seco voie) et 2) les œstrogènes (4,5-seco sentier). Néanmoins, les 3 voies cataboliques des stéroïdes convergent finalement à HIP (Fig. 1) et les gènes cataboliques HIP sont conservés dans les génomes de toutes les bactéries caractérisées utilisant des stéroïdes (Annexe SI, fig. S11) (11, 60).

Les cobamides tels que la cobalamine sont une famille de biomolécules de tétrapyrrole contenant du cobalt avec des fonctions biochimiques essentielles dans les 3 domaines de la vie, servant de groupe prothétique pour diverses méthyltransférases, isomérases et déshalogénases réductrices (61). Avant cette étude, les accepteurs de méthyle connus pour les méthyltransférases dépendantes de la cobalamine comprenaient le tétrahydrofolate et l'homocystéine dans la plupart des organismes (43, 48, 62) ainsi que le CoM et la tétrahydrométhanoptérine chez les archées méthanogènes (38, 53). Ici, nous avons démontré que les œstrogènes sont des accepteurs de méthyle terminaux d'une méthyltransférase dépendante de la cobalamine dans une protéobactérie dénitrifiante, révélant un rôle inattendu de la cobalamine dans le métabolisme des stéroïdes. Étant donné que les stéroïdes sexuels sont impliqués dans les interactions métaboliques bidirectionnelles entre les bactéries et leurs hôtes eucaryotes, la découverte de la rétroconversion des œstrogènes en androgènes chez les bactéries laisse présager des interdépendances métaboliques microbe-hôte inexplorées via cette réaction de méthylation des œstrogènes médiée par Emt. Par conséquent, la emtABCD groupe de gènes peut servir de biomarqueur pour élucider l'occurrence de la rétroconversion des œstrogènes dans le microbiote eucaryote.


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Remerciements

Nous remercions Z. Keresztes, V. Muntean, T. Szőke-Nagy, M. Alexe, A. Cristea et A. Baricz pour leur soutien technique lors de l'échantillonnage et de la préparation des échantillons, et E. A. Levei et M. Șenilă pour leurs contributions aux analyses chimiques. P.-A.B a été soutenu par la bourse de recherche PN-III-P4-ID-PCE-2016-0303 (Autorité nationale roumaine pour la recherche scientifique). H.L.B. a été soutenu par les bourses de recherche PN-III-P4-ID-PCE-2016-0303 (Autorité nationale roumaine pour la recherche scientifique) et STAR-UBB Advanced Fellowship-Intern (Université Babeș-Bolyai). COMME UN. a été soutenu par les bourses de recherche : 17-04828 S (Agence des subventions de la République tchèque) et MSM200961801 (Académie des sciences de la République tchèque). M.M. a été soutenu par le programme postdoctoral PPPLZ L200961651 (Académie des sciences de la République tchèque). R.G. a été soutenu par la bourse de recherche 17-04828 S (Agence des subventions de la République tchèque).


Discussion

L'objectif principal de cette étude était d'examiner la réponse des ??-protéobactérie S. gotlandica GD1 T vers les changements de DIC et de pH. Cela pourrait être réalisé en évaluant l'impact des changements dans la concentration de CID et le pH sur la croissance et le nombre maximal de cellules de S. gotlandica GD1 T dans des expériences de croissance en culture discontinue.

Le sulfure d'hydrogène est le substrat principal des eaux anoxiques et S. gotlandica Le GD1 T semble être principalement responsable de l'oxydation du sulfure d'hydrogène en mer Baltique (Grote et al. 2012 ). Cependant, à l'interface oxique-anoxique et dans la zone sulfurée supérieure, les concentrations de thiosulfate se situent dans une fourchette similaire aux concentrations de sulfure d'hydrogène (Bruckner et al. 2013 ) et le thiosulfate sert de substrat alternatif pour S. gotlandica GD1 T . Nous avons utilisé du thiosulfate comme donneur d'électrons dans les expériences car les concentrations de substrat peuvent être bien mieux contrôlées par rapport au sulfure d'hydrogène. Bien que le thiosulfate semble être entièrement consommé à la fin de l'expérience (voir Fig. 3), des expériences antérieures avec cette souche n'ont pas produit un nombre de cellules plus élevé avec des concentrations de thiosulfate plus élevées (Bruckner et al. 2013 Labrenz et al. 2013 ). Par conséquent, d'autres facteurs potentiellement limitants, liés à la concentration cellulaire, doivent être pris en compte, tels que l'accumulation de produits métaboliques inhibiteurs.

Estimation de la saturation DIC pour la croissance

Les effets stimulants de la croissance de l'augmentation des concentrations de CID pour le phytoplancton sont bien documentés (par exemple, Iglesias-Rodriguez et al. 2008 ) alors que peu d'études ont été réalisées avec des bactéries chimiolithoautotrophes. D'après les concentrations actuelles de DIC d'environ 2 mmol L −1 et 3,5 mmol L −1 (Frey et al. 1991 Beldowski et al. 2010 ) dans les zones redox de la Baltique et de la mer Noire, nos résultats montrent que ces concentrations de DIC sont bien dans la fourchette supportant une croissance maximale de S. gotlandica GD1 T et epsilonprotéobactéries apparentées. Les résultats suggèrent qu'une augmentation supplémentaire de la concentration de DIC dans les zones redox ne devrait pas avoir d'effet direct supplémentaire sur ces bactéries.

Une concentration plus élevée de DIC dans l'océan provoque un déplacement de la spéciation DIC vers le dioxyde de carbone, ce qui entraîne une diminution du pH, c'est-à-dire qu'à pH 7,1 90 % de la spéciation DIC est du carbonate acide tandis qu'à pH 6,3 le reste passe à 50 % d'hydrogène carbonate et 50 % de dioxyde de carbone (Defeyes 1965). Cependant, ce changement de spéciation ne devrait pas avoir d'influence sur la croissance des S. gotlandica GD1 T en concentration DIC de 800 ??mol L -1 était déjà suffisant pour favoriser un nombre maximal de cellules (Fig. 1). Des courbes de saturation comparables pour des concentrations croissantes de DIC ont été déterminées pour d'autres espèces bactériennes et phytoplanctoniques. Clark et Flynn ( 2000 ) ont décrit la relation entre la croissance spécifique du carbone et la concentration en CID de plusieurs phytoplanctons marins. La plupart de ces espèces ont atteint une saturation entre 500 et 1000 ??mol L -1 DIC. De plus, Dobrinski et al. ( 2005 ) ont montré que pour le chimiolithoautotrophe ??-protéobactérie Thiomicrospira crunogena, isolée d'un évent hydrothermal, la concentration en CID à demi-saturation était de 220 ??mol L −1 et la saturation a été atteinte à 1000 ??mol L −1 DIC, qui est dans la même gamme que les valeurs déterminées pour S. gotlandica GD1 T . En revanche, Scott et Cavanaugh ( 2007 ) ont montré que le chimioautotrophe velum de solemya les symbiotes atteignent la saturation à un CO2 concentration de 100 ??mol L -1 . Cependant, cette saturation est également bien dans la gamme du CO2 concentration dans l'environnement, où S. velum a été collecté. De plus, ils pourraient prouver que ces symbiotes dépendent du CO2 et pas au bicarbonate.

Les données génomiques indiquent que S. gotlandica GD1 T est capable d'utiliser à la fois du CO2 et le bicarbonate en convertissant le bicarbonate intracellulaire en CO2 avec l'anhydrase carbonique (Grote et al. 2012 ). De plus, Dobrinski et al. ( 2005 ) pourrait prouver que le chimiolithoautotrophe ??-protéobactérie Thiomicrospira crunogena a la capacité d'utiliser à la fois du CO externe2 et bicarbonate. Par conséquent, il semble probable que S. gotlandica GD1 T a également la capacité d'utiliser à la fois du CO externe2 et le bicarbonate comme source de carbone inorganique.

Effets de différentes valeurs de pH sur la croissance chimiolithoautotrophe

La gamme de pH à laquelle S. gotlandica GD1 T s'est bien développé (pH 6,6-8,0) était relativement étroit par rapport à celui d'autres protéobactéries chimiolithoautotrophes. Par exemple plusieurs ??-protéobactérien Thiomicrospire les espèces des cheminées hydrothermales se sont développées dans une large gamme de pH de 5,3 à 8,5 ou de 4,0 à 7,5 (Brinkhoff et al. 1999 ). Aussi pour les autres chimioautrophes ??-protéobactéries une plage de pH tolérable relativement large a été trouvée, par exemple pour Sulfurimonas paralvinellae et Sulfurimonas autotrophica, la plage de pH était respectivement de 5,4 à 8,6 (optimum 6,1) et de 5,0 à 9,0 (optimum 6,5) (Inagaki et al. 2003 Takai et al. 2006 ). Sulfurimonas denitrificans, le plus proche parent cultivé de S. gotlandica GD1 T (Grote et al. 2012 ), a un pH optimal de 7,0 (Timmer-ten Hoor 1975 ). La plupart de ces bactéries étudiées avec une gamme de pH plus étendue par rapport à S. gotlandica GD1 existe dans des habitats tels que les cheminées hydrothermales, où les changements de pH sont fréquents et rapides. Ainsi, la plage de pH étendue suggère qu'il s'agit d'une adaptation aux conditions extrêmement variables, alors que S. gotlandicune chaîne GD1 a été isolé d'un habitat relativement stable. Scott et Cavanaugh ( 2007 ) confirment cette conclusion avec leurs études sur les chimioautotrophes . ??-protéobactéries, vivant comme endosymbiotes dans les interfaces sulfure/oxique. Ces velum de solemya les symbiotes ont également une gamme relativement étroite de pH optimal (entre pH 7,4 et 8,5), montrant le même déclin marqué de la croissance directement en dessous et au-dessus de ces niveaux.

L'utilisation du substrat ne différait pas significativement entre le pHs 7.1 et 6.6. Cependant, à un pHs en dessous de 6,6, la situation a radicalement changé et la croissance de S. gotlandica La GD1 était manifestement altérée et la consommation de nitrate et de thiosulfate était fortement réduite. Ainsi, le rôle fonctionnel important de S. gotlandica Le GD1 T dans les cycles redoxcline de l'azote et du soufre serait probablement impacté.

Bien que le pH intracellulaire n'ait pas été mesuré dans cette étude, il est supposé que le pH intracellulaire varie d'environ 0,1 unité par unité de changement du pH externe (Hackstadt 1983). Selon Booth (1985), des changements de pH en dehors de l'optimum de pH conduisent à une inhibition à la fois de l'activité enzymatique et de la croissance cellulaire (Booth 1985). Cependant, jusqu'à présent, le mécanisme exact de la régulation du pH intracellulaire n'est pas complètement compris. Des études antérieures ont montré que la régulation dépend de l'énergie et nécessite une fréquence respiratoire élevée (Booth 1985). Par conséquent, l'utilisation élevée de substrat par bactérie à pHs 6,55 pourrait s'expliquer au moins partiellement par une régulation du pH intracellulaire en dehors du pH optimal.

Comme l'utilisation du substrat dans les expériences de culture par lots était significativement plus élevée que dans des conditions environnementales, les résultats reflètent plutôt la capacité de charge de S. gotlandica GD1 T aux conditions données. Les études futures devraient viser à simuler plus précisément les conditions in situ (par exemple, avec des cultures chemostat). En raison du réchauffement climatique et de l'augmentation du CO2 concentrations dans l'atmosphère, une augmentation de la concentration de CID et une diminution du pH d'environ 0,3 unité dans l'océan, connue sous le nom d'acidification de l'océan, sont prévues (Houghton et al. 2001 ). Nos résultats suggèrent qu'un impact direct de l'acidification sur S. gotlandica GD1 T et les organismes apparentés ne devraient pas être très forts, car la plage de pH optimale pour cet organisme modèle se situe toujours dans la plage des changements de pH prévus. En revanche, les effets indirects sur S. gotlandica GD1 T pourrait être plus important que les directs. Par exemple, il est prouvé que la nitrification, le processus qui fournit du nitrate pour les bactéries dénitrifiantes, est influencée négativement par une diminution du pH et une augmentation de la pCO.2 (Huesemann et al. 2002 Denecke et Liebig 2003 Hutchins et al. 2009 ).


RÉSULTATS

Augmentation du débit sanguin pulmonaire chez les agneaux shunt.

Tous les agneaux shunt avaient un frisson palpable et une augmentation de la saturation en oxygène entre le ventricule droit et l'artère pulmonaire, démontrant la perméabilité du greffon. En fait, le rapport du débit sanguin pulmonaire au débit sanguin systémique des agneaux shunt était de 2,9 ± 0,9. Comparativement aux agneaux témoins de 2 semaines, les agneaux shunt de 2 semaines présentaient une augmentation de la pression artérielle pulmonaire moyenne (21,7 ± 3,2 contre 15,3 ± 2,3 mmHg), du débit sanguin pulmonaire gauche (147,3 ± 23,4 contre 55,1 ± 13,2), et la pression auriculaire gauche (6,8 ± 3,7 vs. 2,7 ± 1,6 mmHg) (P < 0.05). Les valeurs de pression auriculaire droite, de fréquence cardiaque et de pression artérielle systémique moyenne étaient similaires entre les groupes.

Diminution de l'expression des enzymes impliquées dans l'homéostasie de la carnitine chez les agneaux shunt.

Initialement, nous avons mesuré l'expression des trois enzymes mitochondriales importantes impliquées dans le métabolisme de la carnitine : CPT1-B, CPT2 (impliquées dans le transport des acides gras à longue chaîne du cytosol à la matrice mitochondriale) et CrAT (transesterfie les chaînes acyles à courte chaîne) chez des agneaux shunt et témoins du même âge de 2 semaines. Il y avait une diminution significative de l'expression des deux CPT1-B (Fig. 1, UNE et B) et les enzymes CPT2 (Fig. 1, C et ) dans les shunts par rapport aux agneaux témoins du même âge. De même, l'expression de CrAT (Fig. 2, UNE et B) et l'activité (témoin : 152,9 ± 46,1 unités/mg vs shunt : 7,43 ± 3,33 unités/mg, P < 0,05 par rapport au témoin Fig. 2C) ont été significativement diminués en shunt par rapport aux agneaux témoins du même âge.

Fig. 1.Expression de la carnitine palmitoyltransférase (CPT) dans le tissu pulmonaire périphérique d'agneaux témoins et shunt à l'âge de 2 semaines. UNE: des extraits protéiques (50 µg) préparés à partir de poumon périphérique d'agneaux shunt et témoins ont été analysés par Western blot en utilisant un antisérum spécifique dirigé contre la protéine CPT1-B. L'expression de CPT1-B a également été normalisée pour le chargement en utilisant la -actine. Une tache représentative est montrée. B: il y avait une diminution significative des valeurs densitométriques normalisées pour la protéine CPT1-B dans le tissu pulmonaire périphérique préparé à partir de shunt par rapport aux agneaux témoins. Les valeurs sont des moyennes ± SE m = 6 agneaux témoins et 6 agneaux shunt. *P < 0,05 par rapport au témoin. C: des extraits protéiques (50 µg) préparés à partir de poumon périphérique d'agneaux shunt ou témoins ont été analysés par analyse Western blot en utilisant un antisérum spécifique dirigé contre la protéine CPT2. L'expression de CPT2 a également été normalisée pour le chargement en utilisant la -actine. Une tache représentative est montrée. : il y avait une diminution significative des valeurs densitométriques normalisées pour la protéine CPT2 dans le tissu pulmonaire périphérique préparé à partir de shunt par rapport aux agneaux témoins. Les valeurs sont des moyennes ± SE m = 6 agneaux témoins et 6 agneaux shunt. *P < 0,05 par rapport au témoin.


Figure 2.Expression et activité de la carnitine acétyltransférase (CrAT) dans le tissu pulmonaire périphérique d'agneaux témoins et shunt à l'âge de 2 semaines. UNE: des extraits protéiques (50 µg) préparés à partir de poumon périphérique d'agneaux shunt et témoins ont été analysés par Western blot en utilisant un antisérum spécifique dirigé contre la protéine CrAT. L'expression de CrAT a également été normalisée pour le chargement en utilisant la β-actine. Une tache représentative est montrée. B: il y avait une diminution significative des valeurs densitométriques normalisées pour la protéine CrAT dans le tissu pulmonaire périphérique préparé à partir de shunt par rapport aux agneaux témoins. Les valeurs sont des moyennes ± SE m = 6 agneaux témoins et 6 agneaux shunt. *P < 0,05 par rapport au témoin. C: L'activité CrAT a été déterminée dans des extraits de protéines (40 g) préparés à partir de tissu pulmonaire périphérique d'agneaux témoins et shunts. Il y avait une diminution significative de l'activité CrAT dans le tissu pulmonaire périphérique préparé à partir de shunt par rapport aux agneaux témoins. Les valeurs sont exprimées en unités d'activité par g de protéine et sont des moyennes ± SE m = 4 agneaux témoins et 4 agneaux shunt. *P < 0,05 par rapport au témoin.

L'augmentation de la nitration diminue l'activité de la CrAT chez les agneaux shunt.

Bien que nos données aient indiqué que l'expression de CrAT était diminuée ∼ 2 fois, l'activité CrAT était diminuée ∼ 20 fois. Cela suggère qu'une modification post-traductionnelle altère l'activité de la CrAT. Comme nous avions précédemment constaté qu'il y avait une augmentation du stress oxydatif chez les agneaux shunt, nous nous sommes concentrés sur le rôle potentiel de la nitration enzymatique. Les niveaux de CrAT nitrée ont été déterminés par immunoprécipitation avec un antisérum spécifique dirigé contre les résidus de 3-nitrotyrosine et se sont avérés être significativement augmentés en shunt par rapport aux agneaux témoins du même âge (Fig. 3, UNEet B). De plus, nous avons constaté que l'exposition de la CrAT purifiée au peroxynitrite (10 M, 5 min) était suffisante pour réduire significativement l'activité de la CrAT (véhicule : 99,9 ± 17,74 unités/μg vs. peroxynitrite : 0,6481 ± 0,24 unités/μg, P < 0,05 vs véhicule Fig. 4).

Figure 3.Augmentation de la nitration de CrAT dans le tissu pulmonaire périphérique d'agneaux shunt à l'âge de 2 semaines. UNE: des extraits protéiques (1 000 µg) préparés à partir de poumon périphérique d'agneaux shunt et témoins ont été soumis à une immunoprécipitation (IP) à l'aide d'un anticorps spécifique de la 3-nitrotyrosine (3-NT) puis analysés par Western blot à l'aide d'un antisérum spécifique dirigé contre la CrAT protéine. Un immunoblot (IB) représentatif est montré avec l'expression de CrAT. Une liaison minimale a été observée dans les billes seules ou dans le préclair IgG. B: il y avait une augmentation significative de la protéine CrAT nitrée dans le tissu pulmonaire périphérique préparé à partir de shunt par rapport aux agneaux témoins. Les valeurs sont des moyennes ± SE m = 6 agneaux témoins et 6 agneaux shunt. *P < 0,05 par rapport au témoin.


Figure 4.Le peroxynitrite diminue l'activité de la CrAT. CrAT de muscle de poitrine de pigeon purifié a été exposé à du peroxynitrite ou à un véhicule authentique, puis l'activité a été déterminée. Le peroxynitrite a induit une diminution significative de l'activité de la CrAT. Les valeurs sont des moyennes ± SD m = 6. *P < 0,05 par rapport au véhicule.

Une activité réduite de la CrAT entraîne des altérations du métabolisme de la carnitine.

CrAT plays an important role in maintaining carnitine metabolism (10). Therefore, we next determined total carnitine and free carnitine levels in the peripheral lung of shunt and control lambs. Using HPLC analysis, we found that total carnitine levels were unchanged in shunt lambs (60.54 ± 8.45 vs. 72.37 ± 10.14 nmol/g wet wt Table 1). However, free carnitine levels were decreased (34.86 ± 3.35 vs. 67.57 ± 13.43 nmol/g wet wt, P < 0.05 vs. control Table 1). Furthermore, l -carnitine levels were significantly lower in shunt compared with age-matched control lambs (20.21 ± 4.29 vs. 56.41 ± 12.27 nmol/g wet wt, P < 0.05 vs. control Table 1). Since free carnitines and other acylcarnitines contribute to total carnitine levels, these data indicate that the percentage of carnitine present as acylcarnitine (calculated as total carnitine minus free carnitine) is significantly higher in shunt lambs (40.71 ± 9 vs. 6.2 ± 4.7%, P < 0.05 vs. control Table 1).

Tableau 1. Carnitine levels in peripheral lungs of shunt and control lambs

Data are means ± SE m = 5.

Altered carnitine metabolism is associated with mitochondrial dysfunction in shunt lambs.

Since the carnitine acyltransferase pathway has been shown to be of critical importance for maintaining normal mitochondrial function, we next determined whether shunt lambs present with markers of mitochondrial dysfunction. Because loss of SOD2 (8, 13, 18, 26, 35, 44, 48) and increases in UCP-2 (2, 27, 42, 46, 62) have been shown to be markers of mitochondrial dysfunction in other systems, we examined these markers. Our data indicate that SOD2 expression was significantly decreased (Fig. 5, UNE et B) in shunt lambs, whereas UCP-2 expression was significantly increased (Fig. 5, C et ). In addition, we determined the lung levels of lactate and pyruvate in shunt and control lambs to quantify mitochondrial activity. Under normal mitochondrial function, pyruvate levels are higher than lactate, and thus any increases in lactate levels decreases the pyruvate-to-lactate ratio and can be extrapolated to suggest a reduction in ATP generation by the mitochondria (57). As shown in Table 2, shunt lambs had significantly decreased pyruvate levels (0.059 ± 0.007 vs. 0.132 ± 0.028 μmol/g wet wt, P < 0.05) and increased lactate levels (0.568 ± 0.838 vs. 1.348 ± 0.214 μmol/g wet wt, P < 0.05) as well as a significant reduction in the pyruvate-to-lactate ratio.

Fig. 5.Markers of mitochondrial dysfunction are increased in shunt lambs at 2 wk of age. UNE: protein extracts (25 μg) prepared from peripheral lung of shunt and control lambs were analyzed by Western blot analysis using a specific antiserum raised against SOD2 protein. SOD2 expression was also normalized for loading using β-actin. A representative blot is shown. B: there was a significant decrease in normalized densitometric values for SOD2 protein in peripheral lung tissue prepared from shunt compared with control lambs. Values are means ± SE m = 6 control and 6 shunt lambs. *P < 0.05 vs. control. C: protein extracts (25 μg) prepared from peripheral lung of shunt and control lambs were analyzed by Western blot analysis using a specific antiserum raised against uncoupling protein-2 (UCP-2). UCP-2 expression was also normalized for loading using β-actin. A representative blot is shown. : there was a significant increase in normalized densitometric values for UCP-2 protein in peripheral lung tissue prepared from shunt compared with control lambs. Values are means ± SE m = 6 control and m = 6 shunt lambs. *P < 0.05 vs. control.

Tableau 2. Lactate and pyruvate levels in peripheral lungs of shunt and control lambs

Data are means ± SE m = 5.

Mitochondrial dysfunction attenuates HSP90-eNOS interaction and shear-induced NO production in PAEC.

To further investigate the effect of mitochondrial dysfunction on NO signaling, we utilized cultured PAEC isolated from juvenile lambs. Mitochondrial dysfunction was induced in PAEC by using 2,4-DNP (50 μM, 0–6 h). Our data indicate that 2,4-DNP significantly decreased ATP levels in PAEC (Fig. 6UNE) associated with an increase in oxidative stress within the mitochondria (Fig. 6B). Furthermore, we found that this mitochondrial dysfunction was associated with a decrease in the association of HSP90 with eNOS (Fig. 7, UNEet B) and shear-induced NO production (Fig. 7C) and an increase in eNOS-derived superoxide (Fig. 7), indicating that impaired mitochondrial function reduces NO production.

Fig. 6.2,4-Dinitrophenol (2,4-DNP) decreases ATP levels and increases mitochondrial oxidative stress in pulmonary arterial endothelial cells (PAEC). UNE: PAEC were treated with 2,4-DNP (25 μM, 0–8 h), and the cellular ATP levels were then determined. 2,4-DNP significantly decreased cellular ATP levels. Values are means ± SE m = 6. T, time. *P < 0.05 vs. control. B: PAEC were treated with 2,4-DNP (25 μM, 4 h). Cells were then exposed to MitoSox (10 μM, 15 min) to measure mitochondrial superoxide levels (as a marker for mitochondrial dysfunction). 2,4-DNP induced a significant increase in MitoSox fluorescence (representative images are shown as an inset). Values are means ± SE m = 4. *P < 0.05 vs. untreated.


Fig. 7.2, 4-DNP decreases NO signaling in PAEC. UNE: PAEC were treated with 2,4-DNP (25 μM, 4 h) and washed with PBS, and lysates were prepared with modified RIPA buffer. IP was performed using an antibody to endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and then Western blot analysis was done using a specific antiserum raised against heat shock protein 90 (HSP90). Blots were also stripped and reprobed for eNOS to normalize the IP. A representative blot is shown. B: 2,4-DNP treatment caused a significant reduction in eNOS-HSP90 interaction. Values are means ± SE m = 3. *P < 0.05 vs. untreated. C: cells were treated with 2,4-DNP (25 μM, 4 h) and exposed to laminar shear stress (20 dyn/cm 2 , 15 min), and then the medium was assayed for nitrate/nitrite (NOX) as an indirect determination of NO production. 2,4-DNP significantly decreased the shear-mediated increase in NOX. Values are means ± SE m = 6. *P < 0.05 vs. no shear. ??P < 0.05 vs. control. : cells were treated with 2,4-DNP (25 μM, 4 h) in the presence and absence of the NOS inhibitor 3-ethylisothiourea (ETU 100 μM) and then exposed to laminar shear stress (20 dyn/cm 2 , 15 min). Superoxide levels were then determined using the spin trap 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine·HCl. 2,4-DNP significantly increased NOS-dependent superoxide generation in response to shear. Values are means ± SE m = 3. *P < 0.05 vs. no shear. ??P < 0.05 vs. shear + 2,4-DNP.

Decreased HSP90-eNOS interaction and altered NO signaling in shunt lambs.

To determine the effect of decreased mitochondrial function in shunt lambs on NO signaling, we carried out immunoprecipitation studies to determine eNOS-HSP90 interactions in both 2- and 4-wk-old shunt and control lambs. Our data indicate that there was a progressive decrease in eNOS-HSP90 interactions between 2 and 4 wk of age in shunt compared with control lambs (Fig. 8, UNE et B) and that this was associated with a progressive decrease in relative eNOS activity (as determined by tissue NOX levels as a fraction of calcium-dependent [ 3 H]arginine metabolism, Fig. 8C) and increased NOS-dependent superoxide levels indicative of eNOS uncoupling (Fig. 8). We also confirmed the specificity of ETU for NOS-derived superoxide by demonstrating that ETU did not quench the superoxide generated by a xanthine/xanthine oxidase superoxide-generating system (Fig. 8E).

Fig. 8.Progressive decreases in the interaction of eNOS with HSP90 in shunt compared with control lambs. UNE: the interaction of eNOS with HSP90 was determined by IP using specific antiserum raised against eNOS in tissue extracts prepared from peripheral lung of shunt and control lambs at 2 and 4 wk of age. IP extracts were analyzed using antisera against either eNOS or HSP90. A representative image is shown. No specific protein bands were observed in the beads alone or in IgG preclear. B: the levels of eNOS protein associated with HSP90 relative to total eNOS protein were calculated. The data obtained indicate that there was a progressive decrease in the association of eNOS with HSP90 in shunt compared with control lambs between 2 (bars at la gauche) and 4 wk of age (bars at droit). Values are means ± SE m = 5 shunt and 5 control lambs at each age. *P < 0.05 compared with age-matched control. ??P < 0.05 vs. 2-wk shunt. C: relative eNOS activity was estimated in shunt and age-matched control lambs at 2 and 4 wk of age by dividing peripheral lung tissue NOX levels by total lung eNOS activity (determined by calcium-dependent [ 3 H]arginine to [ 3 H]citrulline conversion). Relative eNOS activity was significantly lower in the shunt lambs at both 2 and 4 wk of age. Values are means ± SE m = 4 shunt and 4 control lambs at each age. *P < 0.05 compared with age-matched control. ??P < 0.05 vs. 2-wk shunt. : superoxide anion levels determined by electron paramagnetic resonance (EPR) in snap-frozen lung tissue from shunt and age-matched control lambs at 4 wk of age in the presence and absence of the NOS inhibitor ETU (100 μM). A bar graph representing the cumulative data is shown. ETU-inhibitable superoxide levels were significantly higher in the shunt lambs. Values are means ± SD m = 6 shunt and 6 control lambs at each age. *P < 0.05 compared with age-matched control. ??P < 0.05 vs. 2-wk shunt. E: superoxide was generated in vitro by cross-reacting xanthine oxidase (XO 1 U/ml) with xanthine (X 1 mM) in the presence or absence of ETU (100 μM). Two control reactions, one lacking X and the other lacking XO, were included to ensure the absence of nonspecific reactions of either reagent with the EPR spin trap. The significant increase in superoxide generated by the X/XO reaction was not significantly quenched by the presence of ETU. Values are means ± SE m = 3 for each condition. *P < 0.05 compared with X alone. ??P < 0.05 vs. XO alone.


Global transcriptome analysis of the tetrachloroethene-dechlorinating bacterium Desulfitobacterium hafniense Y51 in the presence of various electron donors and terminal electron acceptors

Desulfitobacterium hafniense Y51 is a dechlorinating bacterium that encodes an unusually large set of O-demethylase paralogs and specialized respiratory systems including specialized electron donors and acceptors. To use this organism in bioremediation of tetrachloroethene (PCE) or trichloroethene (TCE) pollution, expression patterns of its 5,060 genes were determined under different conditions using 60-mer probes in DNA microarrays. PCE, TCE, fumarate, nitrate, and dimethyl sulfoxide (DMSO) respiration all sustain the growth of strain Y51. Global transcriptome analyses were thus performed using various electron donor and acceptor couples (respectively, pyruvate and either fumarate, TCE, nitrate, or DMSO, and vanillate/fumarate). When TCE is used as terminal electron acceptor, resulting in its detoxification, a series of electron carriers comprising a cytochrome bd-type quinol oxidase (DSY4055-4056), a ferredoxin (DSY1451), and four Fe&ndashS proteins (DSY1626, DSY1629, DSY0733, DSY3309) are upregulated, suggesting that the products of these genes are involved in PCE oxidoreduction. Interestingly, the PCE dehalogenase cluster (pceABCT) is constitutively expressed in the media tested, with pceT being upregulated and pceC downregulated in pyruvate/TCE-containing medium. In addition, another dehalogenation enzyme (DSY1155 coding for a putative chlorophenol reductive dehalogenase), is induced 225-fold in that medium, despite not being involved in PCE respiration. Remarkably since the reducing equivalents formed during pyruvate conversion to acetyl-CoA are channeled to electron acceptors including halogenated compounds, pyruvate induces expression of a pyruvate:ferredoxin oxidoreductase. This study paves the way to understanding the physiology of D. hafniense, optimizing this microbe as a bioremediation agent, and designing bioarray sensors to monitor the presence of dechlorinating organisms in the environment.

Journal

Journal of Industrial Microbiology Biotechnology &ndash Springer Journals


Release Notes for EcoCyc Version 4.0

The most significant changes are marked with a "*".

Changes to the EcoCyc Data

  • EcoCyc describes all published pathways of E. coli metabolism. The following pathways were added since version 3.7:
    • carnitine metabolism, CoA-linked
    • enterobactin synthesis
    • phenylethylamine degradation

    All genes defined in this Genbank entry (which we term the "Blattner genes") were loaded into EcoCyc by merging the Blattner genes with gene objects that existed previously in EcoCyc. The initial merging was performed programmatically by matching the gene names assigned to the Blattner genes against the gene names and synonyms maintained in EcoCyc. These matches were confirmed by checking the Swiss-Prot links provided for many genes by the Blattner group with the Swiss-Prot links that exist for many EcoCyc genes. 2497 matches were found of which 2265 were confirmed using the Swiss-Prot links. A number of additional gene correspondences were determined through manual inspection.