Informations

Qu'est-ce qu'une fusion d'activation dans le cadre ?


Dans [1] il est écrit que :

Le séquençage du génome entier et de l'ARN a identifié des fusions FGFR3-TACC3 activant dans le cadre récurrentes

Qu'est-ce qu'une fusion activatrice récurrente dans le cadre ?

[1] Cancer Genome Atlas Research Network, « Caractérisation moléculaire complète du carcinome urothélial de la vessie. », Nature, vol. 507, non. 7492, p. 315-322, mars 2014.


Ceci est expliqué dans l'article lié.

Nous avons trouvé plusieurs translocations récurrentes d'importance pathogène probable, y compris une translocation intra-chromosomique sur le chromosome 4 impliquant FGFR3 et TACC3 (n=3). Les points de rupture étaient dans l'intron 16 (2 cas) ou l'exon 17 (1 cas) de FGFR3 et l'intron 10 de TACC3 (confirmé par séquençage d'ADN et RNA-seq). Tous les trois conduisent à des produits d'ARNm de fusion dont les protéines prédites incluent les 758 acides aminés N-terminaux de FGFR3 fusionnés avec les 191 acides aminés C-terminaux de TACC3 (Fig. 2a). Sur la base de la structure de la protéine de fusion FGFR3-TACC3, nous prédisons qu'elle peut s'auto-dimériser, conduisant à une activation constitutive du domaine kinase de FGFR3. La fusion FGFR3-TACC3, qui a été récemment décrite à la fois dans le glioblastome21 et le cancer de la vessie7,8, représente une cible thérapeutique prometteuse.

Le FGFR3 est un membre de la famille des récepteurs du facteur de croissance des fibroblastes. C'est une kinase transmembranaire qui est normalement activée lors de la liaison du ligand qui déclenche la dimérisation. TACC3 est une protéine qui peut se dimériser à travers un domaine enroulé.

La fusion du gène FGFR3-TACC3 qui est générée par les translocations intra-chromosomiques rapportées génère ainsi une version du récepteur qui est prédite comme étant constitutivement active car elle peut dimériser en l'absence du facteur de croissance.

Récurrent moyens se produisant fréquemment.


Gène de fusion

Introduction

Un gène de fusion est défini comme deux gènes qui sont joints de sorte qu'ils soient transcrits et traduits en une seule unité. Des fusions de gènes peuvent se produire in vivo, à la fois naturellement et à la suite de manipulations génétiques, et peuvent être construits in vitro en utilisant des techniques de recombinaison de l'ADN. Ils se produisent dans la nature au cours de l'évolution, par exemple, lorsque deux gènes dont les produits font partie d'une voie métabolique fusionnent, donnant naissance à une protéine de fusion qui réalise les deux étapes de la voie. Ils peuvent également survenir à la suite de réarrangements chromosomiques : par exemple, l'oncogène BCL-ABL, responsable de la leucémie myéloïde chronique, résulte d'une transposition chromosomique fusionnant les gènes BCL et ABL. Enfin, des fusions de gènes peuvent être créées in vitro utilisant des techniques d'ADN recombinant, souvent pour fusionner un gène rapporteur à un gène qui est à l'étude afin de suivre son expression.


Fond

Les fusions de gènes sont un mécanisme bien connu pour l'activation des oncogènes dans les leucémies, les lymphomes et les sarcomes, avec le BCR-ABL gène de fusion dans la leucémie myéloïde chronique comme exemple prototype [1, 2]. L'identification récente de récidives ETS-translocations familiales dans le cancer de la prostate [3] et EML4-ALK dans le cancer du poumon [4] suggère maintenant que les gènes de fusion pourraient également jouer un rôle important dans le développement des cancers épithéliaux. La raison pour laquelle ils n'avaient pas été détectés auparavant était le manque de techniques appropriées pour identifier les aberrations chromosomiques récurrentes équilibrées dans les profils caryotypiques souvent chaotiques des tumeurs solides.

Le séquençage d'ARN massivement parallèle (RNA-seq) à l'aide d'instruments de séquençage de nouvelle génération permet l'identification de fusions de gènes dans des échantillons de cancer individuels et facilite la caractérisation complète des transcriptomes cellulaires [5–11]. Plus précisément, les nouvelles technologies de séquençage permettent la découverte de molécules d'ARN chimériques, où la même molécule d'ARN est constituée de séquences dérivées de deux loci physiquement séparés. L'ARN-seq à extrémités appariées, où 36 à 100 pb sont séquencés à partir des deux extrémités de molécules d'ADN longues de 200 à 500 pb, est particulièrement approprié pour l'identification de ces transcrits d'ARNm chimériques. Le séquençage de l'ADN du génome entier (ADN-seq) peut également être utilisé pour identifier les réarrangements potentiels de création de gènes de fusion. Cependant, seule une fraction des fusions de gènes prédites sur la base de DNA-seq devrait générer un ARNm de fusion exprimé, ce qui rend cette approche fastidieuse pour découvrir des événements de gènes de fusion oncogènes activés. En revanche, RNA-seq identifie directement uniquement les gènes de fusion qui sont exprimés, fournissant un outil efficace pour identifier les fusions oncogènes candidates.

Dans le cancer du sein, des fusions de gènes récurrentes n'ont été identifiées que dans de rares sous-types, tels que ETV6-NTRK3 dans le carcinome sécrétoire du sein [12] et MYB-NFIB dans le carcinome adénoïde kystique du sein [13]. Ici, nous démontrons l'efficacité de l'ARN-seq apparié dans la détection complète des gènes de fusion. Combiné à une nouvelle stratégie bioinformatique, qui a permis un taux de confirmation de plus de 95 % des événements de fusion identifiés, nous identifions plusieurs nouveaux gènes de fusion dans le cancer du sein à partir d'une seule voie de séquençage sur un instrument Illumina GA2x. Nous validons les événements de fusion et démontrons leur importance biologique potentielle par RT-PCR, fluorescence in situ l'hybridation (FISH) et l'interférence ARN (ARNi), mettant ainsi en évidence l'importance des fusions de gènes dans le cancer du sein.


Résultats

Conception de CICERO

Pour découvrir les divers types de fusions de gènes conducteurs dans le cancer, la conception globale de CICERO consiste à intégrer la cartographie ARN-seq avec des caractéristiques génomiques. Cela a été mis en œuvre à travers les trois étapes clés décrites dans la figure 2a : (1) détection de fusion par assemblage local de novo aux points d'arrêt candidats et analyse des lectures de jonction d'épissage, (2) annotation de fusion comprenant une vérification du cadre de lecture pour les gènes partenaires de fusion, et (3) classement des fusions candidates sur la base des preuves à l'appui dans l'ARN-seq et des correspondances avec les fusions connues. CICERO peut être exécuté à partir d'un cluster local ou sur St. Jude Cloud (https://platform.stjude.cloud/tools/rapid_rna-seq) qui offre un accès facile via une interface interactive pointer-cliquer ou la ligne de commande pour soumettre des tâches par lots. Plus important encore, le pipeline Cloud gère efficacement la rafale de calcul requise pour la cartographie à l'échelle du génome afin d'évaluer l'unicité de chaque fusion candidate. Cela permet de terminer l'ensemble du flux de travail sur le Cloud, de la cartographie RNA-seq à la détection de fusion en quelques heures, même pour les cas avec un nombre massif de réarrangements. Les fusions de gènes prédites peuvent ensuite être importées dans FusionEditor pour une curation manuelle et le fichier curé peut être exporté en tant que résultats finaux (Fig. 2b).

Détection de fusion à l'aide de CICERO. une Un aperçu de l'algorithme CICERO qui consiste en la détection de fusion par l'analyse des points de rupture SV candidats et de la jonction d'épissage, l'annotation de fusion et le classement des ensembles de données clés utilisés à chaque étape sont étiquetés. b Flux de travail de détection de fusion. Un utilisateur peut soumettre un fichier BAM aligné ou un fichier fastq brut en entrée sur un cluster d'ordinateurs local ou sur St. Jude Cloud. La sortie brute peut être organisée à l'aide de FusionEditor et les résultats finaux peuvent être exportés sous forme de fichier texte

Curation manuelle avec FusionEditor

FusionEditor, une extension de notre outil de visualisation ProteinPaint [23], importe la sortie CICERO générée à partir d'un ou plusieurs échantillons dans un navigateur interactif (https://proteinpaint.stjude.org/FusionEditor/) pour prendre en charge la curation manuelle. Au sein de chaque échantillon, les fusions prédites sont répertoriées par niveau de qualité, y compris de haute qualité (HQ), de faible qualité (LQ) ou de lecture, et annotées avec le statut in-frame/troncation afin qu'un utilisateur puisse hiérarchiser la conservation de appels à haute confiance tout en conservant la possibilité de revoir toutes les fusions prédites (Fig. 3).

Interface de visualisation de FusionEditor pour la conservation des fusions prédites à partir d'un échantillon. une Vue du tableau qui montre les cinq fusions « HQ » (haute qualité) dans le cadre prédites dans une LAL infantile (SJINF011_D). Une fusion de 3 gènes impliquant AFF1-RAD51B-KMT2A est reconnue automatiquement et marquée par une case intitulée « multi-seg ». La fusion réciproque KMT2A-AFF1 a également été identifiée comme une fusion HQ in-frame. Les fusions inter et intra-chromosomiques sont étiquetées respectivement en rouge et en noir. Les fusions connues sont étiquetées avec du texte violet (par exemple, KMT2A-AFF1 et FLT3 ITD dans ce cas). b Vue graphique représentant les points d'arrêt sur les domaines protéiques des trois gènes partenaires. Des informations supplémentaires telles que le rapport de lectures chimériques pour chaque point de rupture de fusion sont présentées pour soutenir l'évaluation de la validité de chaque fusion prédite

Chaque fusion peut être visualisée graphiquement (Fig. 3, Fichier supplémentaire 1 : Figure S1) qui montre la position de l'exon et des acides aminés du point de rupture à chaque gène ou locus partenaire par rapport au modèle de gène de référence. Cela permet une évaluation manuelle des domaines protéiques retenus dans la protéine de fusion. FusionEditor peut également afficher des points d'arrêt dans les régions UTR (Fichier supplémentaire 1 : Figure S2), ainsi que des fusions de promoteurs ou intergéniques pour l'examen des événements de détournement d'amplificateur (Fichier supplémentaire 1 : Figure S3). Des fusions complexes impliquant ≥ 3 partenaires peuvent également être identifiées et visualisées (par exemple, fusion AFF1-RAD51B-KMT2A sur la figure 3). Un utilisateur peut modifier les attributs de fusion en changeant le niveau de qualité et le type de fusion, et en joignant plusieurs points d'arrêt dans une fusion multisegment, ou vice versa. Les résultats finalisés peuvent être exportés sous forme de fichier plat pour une analyse en aval.

L'interface permettant d'examiner les sorties de CICERO à partir de plusieurs échantillons permet une identification rapide des fusions de gènes récurrentes dans une cohorte de cancer (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1). Plus précisément, la récurrence de chaque fusion de gènes est résumée dans un tableau (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1b) avec le niveau de qualité attribué. Un utilisateur peut également rechercher des fusions impliquant un gène spécifique, par exemple, toutes les fusions impliquant TERT (comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 : Figure S1c). Pour soutenir une évaluation plus approfondie des événements de détournement d'amplificateur, les utilisateurs peuvent télécharger des valeurs d'expression génique (par exemple, FPKM) à partir d'une cohorte pour l'inspection d'une expression anormalement élevée dans l'échantillon positif à la fusion sélectionné (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1d). Via une interface pointer-cliquer, l'utilisateur peut accéder à des détails supplémentaires tels que la position du point d'arrêt, les informations sur le domaine, le nombre de lectures écrêtées et le niveau d'expression génique dans la cohorte (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1d et e).

Comparaison de CICERO avec d'autres méthodes de détection des fusions de gènes somatiques

L'ensemble de données de référence se compose de 184 fusions de gènes pilotes découvertes dans 170 échantillons de leucémie (m = 119), tumeur solide (m = 13), et une tumeur cérébrale (m = 38) (Fig. 4a, Fichier complémentaire 2 : Tableau S1 et S2) [3, 15, 21]. Ces 184 fusions de gènes, affectant des oncogènes bien caractérisés dans le cancer pédiatrique (Fig. 4b), ont été validées orthogonalement par WGS tumoral normal apparié, séquençage de capture, RT-PCR et/ou FISH. Ils servent donc de bon standard de référence pour la détection de fusion de pilotes, le cas d'utilisation le plus courant pour la détection de fusion à l'aide de RNA-seq. Les fusions de pilotes peuvent être classées en 4 catégories en fonction des caractéristiques génomiques et du statut d'expression : (1) fusions exon-à-exon chimériques hautement exprimées avec FPKM > 5 pour le gène partenaire N-terminal (m = 112) (2) fusions chimériques faiblement exprimées (m = 18) (3) fusions non canoniques (m = 36), défini par l'un des points d'arrêt de fusion étant dans une région non codante et représentant principalement des événements de détournement d'amplificateur et (4) ITD (m = 18).

Comparaison de CICERO avec d'autres méthodes de détection de fusion de pilotes. une Distribution de la leucémie, des tumeurs solides et des tumeurs cérébrales dans les 170 ARN-seq utilisés pour le test de référence. b Prévalence des fusions de gènes récurrentes (≥ 3) dans les ensembles de données de référence stratifiées selon les quatre classes suivantes : transcrit chimérique causé par une fusion exon-à-exon exprimée à un niveau élevé (> 5 FPKM) ou faible, duplication en tandem interne (ITD), et d'autres fusions non canoniques impliquant des régions introniques ou intergéniques. c Comparaison de la sensibilité (panneau supérieur) et classement des fusions de pilotes parmi toutes les fusions prédites (panneau inférieur) par CICERO et cinq autres méthodes (ChimeraScan, deFuse, FusionCatcher, STAR-Fusion et Arriba) dans les quatre catégories de fusion de pilotes. Le classement par CICERO, étiqueté CICERO_raw, est basé sur le score de fusion seul sans incorporer les correspondances à l'état de fusion connu. Les barres d'erreur représentant l'écart type de la sensibilité de détection sur le panneau supérieur ont été calculées par bootstrap d'échantillons avec 100 itérations. Vrais positifs (bleu foncé) et faux positifs (bleu clair) des fusions somatiques prédites identifiées par CICERO et d'autres programmes de détection de fusion. Le nombre exact d'événements est marqué comme (prédiction positive/totale vraie) sous le nom de chaque méthode. Les prédictions de haute qualité de CICERO sont comparées à celles de STAR-fusion et Arriba (panneau de gauche) tandis que toutes les prédictions de CICERO sont comparées à celles de FusionCatcher, deFuse et ChimeraScan (panneau de droite)

Nous avons comparé les performances de CICERO avec cinq méthodes de détection de fusion populaires : ChimeraScan [17], deFuse [16], FusionCatcher [18], STAR-Fusion [19] et Arriba [24]. Toutes ces méthodes produisent un grand nombre de prédictions qui incluent de vraies fusions de gènes ainsi que des faux positifs causés par l'ambiguïté de la cartographie dans les régions répétitives, la lecture transcriptionnelle [25, 26] et d'autres artefacts. Nous avons donc évalué les performances en fonction de la sensibilité de détection, du classement des fusions de pilotes parmi toutes les prédictions par algorithme (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S2) et du taux de faux positifs de toutes les fusions prédites. Afin d'assurer une comparaison équitable, nous avons utilisé le classement CICERO basé sur le score de fusion seul (noté CICERO_raw) qui n'intègre pas la note de qualité basée sur les connaissances. Les événements marqués comme étant en lecture continue sont considérés comme des artefacts et donc exclus dans toutes les méthodes, à l'exception d'Arriba, car les événements en lecture continue marqués par Arriba contiennent des fusions oncogènes hautement exprimées (par exemple, PR2Y8-CRLF2).

CICERO a détecté 95 % des fusions de pilotes avec un classement moyen de 1,9, tandis que ChimeraScan, deFuse, FusionCatcher, STAR-Fusion et Arriba n'ont détecté que 63 %, 66 %, 77 %, 63 % et 78 % avec un classement moyen de 37,0, 9,0, 18,1, 4,4 et 2,9, respectivement (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S2). Dans la catégorie des fusions chimériques canoniques d'exon à exon, le taux de détection est généralement élevé dans toutes les méthodes pour les fusions hautement exprimées (allant de 88 à 100 %, Fig. 4c) mais faible pour les fusions chimériques faiblement exprimées (allant de 22 à 56 %, figure 4c). Dans la catégorie des fusions non canoniques, CICERO a détecté les 36 événements, tandis que les autres méthodes (ChimeraScan, deFuse, FusionCatcher, STAR-Fusion, Arriba) ont détecté respectivement 6, 13, 23, 4 et 22 (Fig. 4c) . Dans trois cas, des fusions de drivers telles que IGH-EPOR et IGH-CRLF2 ont été détectées exclusivement par CICERO (Fichier complémentaire 2 : Tableau S2). Sur les 18 événements ITD dans FLT3 ou FGFR1, CICERO a pu en détecter 17 (Fig. 4c). Aucune des cinq autres méthodes ne prend en charge la détection ITD.

Pour évaluer le taux de faux positifs de toutes les fusions prédites, nous avons considéré comme de vrais positifs les fusions d'ARN qui correspondent aux variations structurelles somatiques dérivées de données WGS d'ADN tumoral-normal appariées, disponibles pour 80 échantillons (méthodes). Les fusions de pilotes détectées sont toutes classées comme de haute qualité par CICERO. Par conséquent, nous avons comparé les prédictions de haute qualité de CICERO avec les appels de STAR-Fusion et Arriba, car ces méthodes prédisaient relativement peu de fusions de gènes. Les prédictions de fusion de ChimeraScan, deFuse et FusionCatcher ont été comparées à tous les appels CICERO. Pour des prédictions de haute qualité, le taux de faux positifs de CICERO, STAR-fusion et Arriba est de 78 %, 91 % et 82 %, respectivement (Fig. 4d, panneau de gauche Fichier supplémentaire 3). Lorsque l'on considère à la fois les prédictions de haute et de basse qualité, le taux de faux positifs de CICERO, FusionCatcher, deFuse et ChimeraScan est de 95 %, 97 %, 95 % et 99 %, respectivement (Fig. 4d, panneau de droite Fichier supplémentaire 3).

Analyse CICERO de l'ARN-seq du cancer de l'adulte

Nous avons exécuté CICERO suivi d'une curation manuelle à l'aide de FusionEditor sur les données RNA-seq de The Cancer Genome Atlas Glioblastoma Multiforme (TCGA-GBM) qui comprenait 167 échantillons de patients GBM adultes (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S3) et avons comparé les résultats aux fusions de gènes signalées. par le réseau de recherche TCGA [27]. Nous nous sommes concentrés sur les fusions de gènes qui avaient au moins un gène partenaire inclus dans le recensement des gènes du cancer de COSMIC [28]. Sur les 40 fusions liées au gène du cancer signalées par le TCGA, CICERO en a détecté 33, dont EGFR-SEPT14, FGFR3-TACC3 et NAA30-TERT (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S4).

141 fusions supplémentaires liées au gène du cancer détectées par CICERO n'ont pas été signalées par le réseau de recherche TCGA, dont 60 impliquaient EGFR, l'un des gènes les plus fréquemment mutés dans le GBM [27]. Les fusions EGFR supplémentaires comprenaient un ITD (TCGA-27-2523) dupliquant le domaine tyrosine kinase (TKD) codé par les exons 18-25, correspondant à une duplication TKD précédemment rapportée dans deux lignées cellulaires de gliome [29]. Les fusions EGFR restantes proviennent de réarrangements intra-chromosomiques dans des régions de 70Kb à 30 Mb éloignées de l'EGFR ou de translocations interchromosomiques (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S5). L'événement le plus répandu, totalisant 39 fusions dans 21 échantillons, provoque la troncature du domaine d'autophosphorylation C-terminal codé par les exons 25-28 (Fig. 5a). La perte C-terminale est également la fusion d'EGFR la plus courante signalée par TCGA. Tous ces éléments ont également été détectés par CICERO. Dans certains cas, plusieurs transcrits de fusion conduisant à une troncature C-terminale de l'EGFR peuvent être détectés dans le même échantillon tumoral, suggérant une éventuelle hétérogénéité clonale [30]. Par exemple, cinq transcrits de fusion causant la troncature C-terminale de l'EGFR ont été prédits par CICERO dans l'échantillon TCGA-06-2557 (Fichier supplémentaire 1 : Figure S4). Alors que l'une de ces cinq fusions, une fusion EGFR-SEPT14 [27] dans le cadre avec 8 lectures de support, a déjà été signalée par le réseau de recherche TCGA, les quatre fusions restantes, y compris la fusion prédominante EGFR-SDK1 hors cadre avec un total sur 357 lectures positives pour la fusion, n'ont pas été signalées. Au total, 13% des échantillons TCGA hébergent des fusions pouvant provoquer une troncature C-terminale, un taux beaucoup plus élevé que les 4% (7 cas) détectés par le TCGA Research Network [27].

Exemples de fusions supplémentaires identifiées par CICERO à partir de la cohorte TCGA-GBM. Le domaine protéique du gène du cancer impliqué dans une fusion est marqué par une légende colorée. une Comparaison des fusions de gènes conduisant à la troncature du domaine d'autophosphorylation terminale de l'EGFR C découvert uniquement par CICERO avec celles rapportées par CICERO et le réseau de recherche TCGA. Les sites marqués comme "Closs" se réfèrent à des fusions de troncature C-terminale hors cadre tandis que ceux marqués d'un symbole de gène se réfèrent à des fusions dans le cadre. b Fusions de gènes susceptibles de provoquer l'activation de la kinase. Pour la fusion KLHL7-BRAF, nous avons sélectionné la protéine codée par l'isoforme courte KLHL7 NM_001172428 car le point de rupture de fusion s'est produit au dernier exon unique de ce transcrit. c Fusion CCDC127-TERT dans TCGA-06-2564 conduisant à une surexpression de TERT. Le panneau de droite montre la valeur FPKM de CCDC127 et TERT de l'ensemble de la cohorte GBM avec le point rouge marquant l'échantillon de fusion TCGA-06-2564

Des exemples notables de fusions non-EGFR non signalées par TCGA incluent trois fusions de kinases dans le cadre, à savoir KLHL7-BRAF, CEP85L-ROS1 et TMEM165-PDGFRA (Fig. 5b), et une fusion CCDC127-TERT (Fig. 5c) . Les trois fusions de kinases conservent toutes le domaine de kinase (Fig. 5b). Alors que KLHL7-BRAF n'a pas été rapporté dans le GBM auparavant, il a été détecté dans le carcinome papillaire de la thyroïde [31]. CEP85L-ROS1 et TMEM165-PDGFRA ont été rapportés par une étude précédente qui définit le paysage des fusions de kinases dans le cancer [32]. La fusion CCDC127-TERT a conduit à l'activation de l'expression de TERT car l'échantillon positif pour la fusion (TCGA-06-2564) a la deuxième expression de TERT la plus élevée de toute la cohorte TCGA (Fig. 5c). Cette fusion a également été rapportée dans une étude précédente qui a étudié le paysage des fusions de transcrits associés au cancer [10].


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Increased kinase signaling

Interleukin 7 (IL7) signaling is essential for normal T-cell development and is triggered by the interaction of IL7 with the heterodimeric IL7 receptor (IL7R). This interaction induces reciprocal JAK1 and JAK3 phosphorylation and subsequent recruitment and activation of STAT5. Upon phosphorylation, STAT5 dimerizes and translocates to the nucleus where it regulates the transcription of many target genes, including the antiapoptotic B-cell lymphoma 2 (BCL-2) family member proteins. 19,20 In addition to the JAK/STAT pathway, the RAS-MAPK and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathways are also activated by IL2, IL7, and stem cell factor (SCF) that act on the developing T cells (Figure 1).

Deregulation of the JAK-STAT signaling cascade in T-ALL. Representation of the different oncogenic mechanisms that lead to aberrant activation of the IL7 signaling in T-ALL. Interaction of IL7 with the heterodimeric IL7R induces reciprocal JAK1 and JAK3 phosphorylation and subsequent recruitment of STAT5. STAT5 dimerizes and translocates to the nucleus where it induces transcription of the prosurvival factor BCL2. IL7 also activates the RAS-MAPK and PI3K kinase pathways. IL7 signaling can indirectly be enhanced by abnormal NOTCH1 signaling, constitutive expression of ZEB2, or by increased presentation of IL7R on the cell surface of thymocytes due to impaired clathrin-dependent endocytosis caused by DNM2 mutations. Promising therapeutic agents targeting the oncogenic IL7-JAK-STAT cascade are indicated in red. *Proteins that are mutated in T-ALL.

Deregulation of the JAK-STAT signaling cascade in T-ALL. Representation of the different oncogenic mechanisms that lead to aberrant activation of the IL7 signaling in T-ALL. Interaction of IL7 with the heterodimeric IL7R induces reciprocal JAK1 and JAK3 phosphorylation and subsequent recruitment of STAT5. STAT5 dimerizes and translocates to the nucleus where it induces transcription of the prosurvival factor BCL2. IL7 also activates the RAS-MAPK and PI3K kinase pathways. IL7 signaling can indirectly be enhanced by abnormal NOTCH1 signaling, constitutive expression of ZEB2, or by increased presentation of IL7R on the cell surface of thymocytes due to impaired clathrin-dependent endocytosis caused by DNM2 mutations. Promising therapeutic agents targeting the oncogenic IL7-JAK-STAT cascade are indicated in red. *Proteins that are mutated in T-ALL.

Activating mutations in IL7R, JAK1, JAK3, and/or STAT5 are present in 20% to 30% of T-ALL cases (Table 1), 4,21,22 with a higher representation within TLX + , HOXA + , and ETP-ALL patient subgroups (Figure 2). 4,23 A small percentage of cases also show aberrations in phosphatases like PTPN2 and PTPRC, which, among other substrates, dephosphorylate and inactivate JAK kinases. 24,25 Interestingly, the IL7R signaling cascade can also be hyperactivated in patients who do not carry any genetic aberrations in the IL7R, JAK, ou STAT5 genes, indicating that still other mechanisms exist to activate this pathway. 26,27 Indeed, only recently was it discovered that loss-of-function mutations in DNM2 lead to increased presentation of IL7R on the cell surface of thymocytes due to impaired clathrin-dependent endocytosis. 26 In addition, a rare translocation targeting the zinc finger E-box–binding homeobox 2 locus (ZEB2) has been recently described in T-ALL, and Zeb2 overexpression was shown to increase Il7r expression and Stat5 activation, promoting T-ALL cell survival in a mouse model. 27 Although most mutations seem to result in activation of JAK1 and JAK3, rare fusion transcripts involving JAK2 have also been described, and wild-type TYK2 may have an important role in activating survival pathways of T-ALL cells. 28,29

Representation of the cooperation of oncogenic events. The major subclasses of T-ALL are shown based on the expression of the transcription factors TAL1, TLX1, TLX3, HOXA gènes, NKX2-1, ou LMO2/LYL1. For each subclass, additional genes are shown that are most frequently mutated in that subclass. The PRC2 complex contains EZH2, SUZ12, and EED.

Representation of the cooperation of oncogenic events. The major subclasses of T-ALL are shown based on the expression of the transcription factors TAL1, TLX1, TLX3, HOXA gènes, NKX2-1, ou LMO2/LYL1. For each subclass, additional genes are shown that are most frequently mutated in that subclass. The PRC2 complex contains EZH2, SUZ12, and EED.

Aberrant activation of the PI3K-AKT pathway results in enhanced cell metabolism, proliferation, and impaired apoptosis. 30,31 Hyperactivation of the oncogenic PI3K-AKT pathway in T-ALL is mainly caused by inactivating mutations or deletions of the phosphatase and tensin homolog (PTEN), the main negative regulator of the pathway. 22,32-36 In addition, some T-ALL cases show gain-of-function mutations in the regulatory and catalytic subunits of PI3K, respectively, p85 and p110, or in the downstream effectors of the cascade such as AKT and mechanistic target of rapamycin (mTOR) (Table 1). 22,35,37 PI3K-AKT signaling activation is also achieved through IL7 stimulation or RAS activation. 22,31,38 A recent study on 146 pediatric T-ALL cases described that almost 50% of the patients harbored at least 1 mutation in the JAK-STAT, PI3K-AKT, or RAS-MAPK pathways, underscoring the importance of activation of those cascades for the leukemic cells. 22

In addition to the activation of the JAK kinases or the PI3K pathway, activation of the ABL1 kinase is observed in up to 8% of T-ALL cases, with 6% of patients expressing the NUP214-ABL1 fusion protein. 39 NUP214-ABL1 is a constitutively active tyrosine kinase that activates STAT5 and the RAS-MAPK pathway, but is much weaker as compared with BCR-ABL1. 39,40 Interestingly, the kinase activity of NUP214-ABL1 is dependent on its location to the nuclear pore 39,41 and its oncogenic properties rely on its interaction with MAD2L1, NUP155, and SMC4 and on the activity of the LCK, a member of the SRC family kinase. 42 All data collected to date suggest that the NUP214-ABL1 fusion kinase is a weak oncogene that cooperates with additional oncogenic events to drive leukemia development. In that sense, it is of interest to note that the NUP214-ABL1 fusion is always found together with TLX1 or TLX3 expression and is often associated with loss of PTPN2, a negative regulator of NUP214-ABL1. 25,39

RAS-activating mutations were recently described in 44% of diagnosis-relapse sample pairs, indicating an overrepresentation of these defects in high-risk ALL. Interestingly, KRAS mutations rendered lymphoblasts resistant toward methotrexate, while sensitizing them to vincristine. 43


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INTRODUCTION

Endocytosis is the process mammalian cells utilize for the uptake of essential molecules from their external environment. This material is taken into cells by membranous vesicles derived from the plasma membrane (endocytic vesicles) and once internalized it is directed to a system of internal vesicles called endosomes [1 ]. In endosomes a number of important sorting events are carried out and include the separation and segregation of the material taken into the cell from the components of the endocytic vesicle. The latter components are returned (recycled) to the plasma membrane for use in subsequent rounds of endocytosis, whereas the endocytosed material is mostly sorted into lysosomes. The endosomal system is composed of a series of distinct elements, some of which are thought to perform sorting (rab5-positive endosomes) or recycling (rab11-positive endosomes) activities [2 ]. Late endosomes (rab7-positive endosomes) appear to participate in routing material destined for degradation from the rab5-positive sorting compartment to the lysosomal compartment.

Rab5 is an important regulator of early events in endocytosis and phagocytosis [3, 4 ]. Over-expression of wild-type rab5a or a constitutively activated rab5a mutant that is deficient in GTP hydrolysis (rab5a:Q79L) maximally stimulate endocytosis in fibroblasts [5 ]. This stimulation is in part a result of increased endosome fusion because rab5 is rate limiting for in vitro endosome-endosome [6 ] as well as in vitro endosome-phagosome fusion [7 ]. Rab5 activation and endosome fusion are further linked by the observation that cells expressing rab5a:Q79L develop giant rab5a-positive endosomal vesicles [5, 8 ]. Time-lapse recordings of cells expressing rab5a:Q79L have shown that the giant vesicles arise primarily by fusion of smaller rab5a-positive endosomal vesicles [8 ]. These observations support the idea that the stimulation of endocytosis caused by rab5 activation is dependent upon an increase in the size of the endosomal compartment.

It is becoming clear that rab5a activity is linked to the activation of an H-ras-linked signal transduction pathway. It has long been known that expression of oncogenic H-ras stimulates endocytosis in cells [9 ] but only recently has this been directly linked to rab5 activation [11, 12 ]. Previous work in our laboratory has shown that fluid-phase endocytosis is stimulated after activation of a signal transduction cascade that includes H-ras, phosphoinositide-3-kinase and protein kinase B [101112 ]. Furthermore, the stimulation of endocytosis by this signal transduction pathway requires rab5 activation, since a dominant-negative rab5a mutant deficient in GTP binding (rab5a:S34N) blocks the stimulation of endocytosis by this signaling pathway. In fibroblasts expressing H-ras:G12V [12 ] in epidermal growth factor (EGF)-stimulated fibroblasts [13 ], the increase in endocytosis is similar to that observed after overexpression of rab5a:Q79L. The mechanisms by which H-ras:G12V or EGF stimulation result in stimulation of endocytosis are currently unknown. Furthermore, whether H-ras:G12V or EGF activation of rab5a in living cells is sufficient to result in the formation of giant GFP-rab5a:wt-positive endosomes is also not known. Further work is required to determine the identity of the molecules that link receptor activation and giant endosome formation.

In this report we have explored the dynamic changes in the structure and activity of the rab5a-positive endosomal and phagosomal compartments in living cells after activation by either expression of H-ras:G12V (or exposure to EGF) and rhodamine-Escherichia coli, respectivement. We used green fluorescent protein (GFP) tagged rab5a:wt and time-lapse confocal microscopy of living cells to examine the regulation of rab5a activation by H-ras:G12V and EGF. Rab5a activation by these agents results in the formation of giant GFP-rab5a:wt-positive vesicles and links stimulated endocytosis with enlargement of the early endosomal compartment. Furthermore, this approach has allowed real-time visualization of the changes in membrane dynamics that have been suggested by previous studies. In addition, the giant vesicles appeared to form by two distinct processes that include vesicle fusion and new vesicle (macropinosome) formation. These data illustrate the importance of rab5a:wt-mediated endosome fusion in stimulated endocytosis.


Discussion

It has been shown previously that functional yeast t-SNAREs marking the Golgi compartment, the plasma membrane, and the vacuole are each composed of a distinct heavy chain from the syntaxin family and, depending on the particular membrane, one or two nonsyntaxin light chains (Fukuda et al., 2000 McNew et al., 2000a Parlati et al., 2000). The architecture of the endosomal t-SNARE further establishes the generality of this concept with Tlg2p as the heavy chain and Tlg1p and Vti1p as its two light chains, respectively, functioning exclusively with Snc2p as its v-SNARE. Moreover, only one topological arrangement of these four proteins between two membranes results in a fusogenic complex, establishing their roles as t-SNARE and v-SNARE, and extending the concept of topological restriction (Parlati et al., 2000).

In yeast, the 21 SNARE proteins have been grouped into four different categories defined by the sequence homology in the SNARE motif: the syntaxins (Ufe1p, Sso1p, Sso2p, Sed5p, Pep12p, Tlg2p, and Vam3p), the Bet1p group (Sec9p-C, Spo20p-C, Vam7p, Bet1p, Sft1p, and Tlg1p), the Bos1p group (Sec9p-N, Spo20p-N, Vti1p, Bos1p, Gos1p, and Sec20p), and a fourth group termed R-SNAREs (Snc1p, Snc2p, Nyv1p, Sec22p, and Ykt6p) (Pelham, 2001 note Sec9p and Spo20p, like their animal homologue SNAP-25, have two SNARE motifs, C and N). All results to date indicate that fusogenic SNARE pins must contain one subunit from each group: t-Sso1p/Sec9p and v-Snc1p or v-Snc2p at the plasma membrane (McNew et al., 2000a) t-Sed5p/Sec22p,Bos1p and v-Bet1p at the Golgi compartment (Parlati et al., 2000) and t-Vam3p/Vam7p,Vti1p and v-Nyv1p at the vacuole (Fukuda et al., 2000). The endosomal t-SNARE also fits this rule, suggesting that it has a concrete structural basis which can be used to predict additional fusogenic SNARE complexes. However, the unique v-SNARE within a particular complex (i.e., based on topological restriction) can be drawn either from the R-SNARE group (Snc1p or Snc2p, Nyv1p) or from the Bet1p group (Bet1p, Sft1p) and potentially (given the limited number of results to date) from the Bos1p group.

Certainly, Tlg2p, Tlg1p, and Snc2p function in endocytosis, but there is also some evidence showing that they are involved in the retrieval of proteins to the TGN from the cell surface or endosomes (Abeliovich et al., 1998 Holthuis et al., 1998b Seron et al., 1998 Gurunathan et al., 2000 Lewis et al., 2000). These functions are of course related in that endosomes play an important role in maintaining the steady-state distribution of late Golgi membrane proteins (Conibear and Stevens, 1998). Therefore, it is possible that the fusogenic SNARE complex we have identified here, t-Tlg2p/Tlg1p,Vti1p and v-Snc1p or Snc2p, is involved in more than just one trafficking step. Indeed, this complex is also required in TGN homotypic fusion (Brickner et al., 2001, this issue).

Our results imply that the fusion activity of this endomal t-SNARE is intrinsically switched “off” due to auto-inhibition. Its fusion activity can be unleashed by binding a peptide corresponding to the COOH-terminal part of the cognate v-SNARE. The capacity to switch the endosomal t-SNARE “on” is specific for peptide derived from its cognate v-SNARE, and when activated the endosomal t-SNARE will only fuse with its cognate v-SNARE Snc1/2p and no other potential v-SNARE encoded in the genome of yeast. Most likely peptide binding conformationally switches the endosomal t-SNARE from “off” to “on” states when it binds, as it does for the neuronal exocytic t-SNARE (unpublished data).

The intrinsic inactivity of the endosomal t-SNARE is a significant finding because it implies that cells must possess mechanisms to activate it for fusion. Presumably, peptide binding throws the switch by tapping into a mechanism that is physiologically reserved for certain regulatory proteins. Indeed, a very recent study showed that Tlg2p is locked in an inactive state, unable to bind its light chains Tlg1p and Vti1p, unless Vps45p is present (Bryant and James, 2001). Interestingly, none of the other t-SNAREs tested to date show a strict requirement for peptides to be functional in the in vitro fusion assay (Fukuda et al., 2000 McNew et al., 2000a Parlati et al., 2000), suggesting that the endosomal t-SNARE might be auto-inhibited to a greater extent.

Of course, regulatory proteins in the cell could tip the balance further toward (or against) the “off” state. Snc1/2p is the sole example to date of a multifunctional v-SNARE. Snc2p is required in the endocytic pathway (in association with t-Tlg2p/Tlg1p,Vti1p) as well as for fusion of secretory vesicles with the plasma membrane (in association with t-Sso1p/Sec9p [McNew et al., 2000a]). Thus, a single v-SNARE suffices for fusion with the plasma membrane and with the two compartments with which the cell surface interfaces for endocytosis and secretion, early endosomes and late Golgi compartment. This neatly solves the problem of how the v-SNAREs are recycled among these compartments. If the only source of specificity for vesicle targeting in these pathways were SNARE pairings, this would imply that the pattern of transport among these compartments could be relatively random. Interestingly, this pattern is extremely complex (Pelham, 1999) and since, in contrast to the genes and organelles in the secretory pathway which are essential, the entire pathway is not essential in yeast (Holthuis et al., 1998b), it is not inconceivable that even a random pattern in these pathways might suffice and would certainly cause no harm. Therefore, it is unclear whether the large number of transport links among endocytic compartments (Pelham, 1999) is due to an equal number of uniquely specific fusion steps, or whether movement could be more random than that. The latter would require a smaller genetic load, but would also result in less overall efficiency in endocytosis.

If the transport pattern were precise, how could the cell direct Snc2p-containing v-SNARE vesicles to one versus another of its potential target membranes? The tight autoregulation of the endosomal t-SNARE, so that its fusion activity is intrinsically locked-up, would be important in this connection. If there is a lock then there is presumably a key, and a simple possibility is that Snc2p-containing vesicles in the cell have additional proteins encoding their origin that act as keys to preferentially unlock one or another different t-SNARE at one or another different target membrane, adding a further level of specificity. Such a “key–lock” system could certainly include such Sec1 family proteins as Vps45p, but also rab GTPase switch proteins or cognate tether proteins (Mellman and Warren, 2000 Zerial and McBride, 2001). Each of the two different t-SNAREs so far known to be fusogenic with v-Snc2p (or Snc1p) has a distinct Sec1 family member: t-Sso1p/Sec9p functions with Sec1p (Carr et al., 1999) and t-Tlg2p/Tlg1p,Vti1p with Vps45p (Nichols et al., 1998). Additional elements, such as cytoskeletal structures, may also play a less direct role in directing Snc2p-containing v-SNARE vesicles to different target membranes. Further studies are needed to establish the extent to which the plasma membrane–endosomal compartments–TGN network operates according to stochastic or deterministic principles.


Département de biologie

Proper transcriptional regulation is essential for the establishment and maintenance of cellular identity. Consistent with its central role in cellular function, transcription is dysregulated in numerous human disorders, including cancer. We use genetic and genomic approaches to study the control of initiation, a critical step in transcription where numerous regulatory inputs are integrated. As many basic transcriptional mechanisms are conserved throughout evolution, we use the budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model system.

We use genome-wide methodologies to study transcriptional regulation. We develoed chromatin endogenous cleavage followed by high-throughput sequencing (ChEC-seq) as a method to map the genome-wide binding of proteins with high spatiotemporal resolution. ChEC-seq involves fusion of micrococcal nuclease (MNase), a calcium-dependent exo-/endonuclease to a chromatin-associated protein of interest. Upon addition of exogenous calcium to cells, MNase cleaves DNA in proximity to binding sites for the factor of interest. Total DNA is then purified and small fragments are sequenced to reveal genomic loci bound by the fusion protein. ChEC-seq has numerous advantages relative to ChIP-based methods: it avoids artifacts associated with crosslinking, sonication, and poor antibody quality, is controlled by calcium, and provides high spatial resolution. We leveraged the inducible nature of MNase to characterize two classes of transcription factor binding sites in budding yeast. We found that sites displaying rapid cleavage displayed robust matches to known DNA motifs, while sites that were cleaved more slowly had no such sequences. We are currently testing ChEC-seq with additional classes of chromatin-binding proteins in budding yeast and are developing the method in metazoan systems.

We are particularly interested in the functions of the Mediator complex, a conserved, essential coactivator generally required for transcription by RNA Polymerase II (RNAPII). Studies of Mediator function in budding yeast have been complicated by conflicting data regarding its genome-wide localization as determined by ChIP-seq. We used ChEC-seq to map the binding of Mediator to the budding yeast genome and confirmed that, under normal growth conditions, it is confined to upstream activating sequences (UASs). We also found that its binding to UASs is generally uncoupled from transcriptional output and that its binding to chromatin is cooperative with that of TFIID, another coactivator complex that is part of the RNAPII pre-initiation complex (PIC). We are using a combination of budding yeast genetics and ChEC-seq to furthur elucidate the role of Mediator in PIC recruitment.

In addition to addressing questions related to basic transcription mechanisms, we are interested in the function of CCCTC-binding factor (CTCF), well known for its function in chromatin insulation. While CTCF is ubiquitously expressed, it has a paralog, brother of the regulator of imprinted sites (BORIS), that is expressed in germ and cancer cells and is comparatively poorly understood. Recent work has demonstrated the existence of clustered CTCF target sites (2xCTSes) that are occupied by CTCF homodimers in BORIS-negative cells but are occupied by CTCF/BORIS heterodimers or BORIS homodimers in BORIS-positive cells. In contrast to single CTCF target sites (1xCTSes), which are though to be involved in chromatin insulation, 2xCTSes are associated with active gene regulatory elements. We are investigating the mechanisms by which CTCF and BORIS influence transcription and chromatin architecture through these two classes of sites and are also exploring novel functions for CTCF and BORIS through mapping their protein-protein interaction landscapes.

Publications

Tourigny JP, Saleh MM, Schumacher K, Devys D, Zentner GE (2018). Mediator is essential for small nuclear and nucleolar RNA transcription in yeast. Mol Cell Biol 38(24):e00296-18.